基于網絡藥理學分析咖啡酰奎寧酸類化合物治療II型糖尿病的作用機制

李玲玉，朱文卿，朱姍姍，張 利，張 鵬，鄭振佳,*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東泰安 271018；2.山東中平藥業有限公司，山東臨沂 273300）

糖尿病屬于內分泌代謝紊亂疾病[1]，國際糖尿病聯合會估計2019年全球有4.63 億糖尿病患者，預計到2045年全球糖尿病患者將達到7 億[2]。糖尿病可分I 型和II 型糖尿病，其中II 型糖尿病患者約占該病的90%[3]，其發病原因主要是由于遺傳基因和不良的生活方式，尚無法根治[4]。II 型糖尿病可引起多種并發癥，導致血管受損并危及心、腦、腎等，嚴重危害人體健康，造成巨大的社會和經濟負擔[5?6]。目前對II 型糖尿病患者主要采取口服降糖藥物、皮下注射胰島素、飲食控制和運動鍛煉等方式調節血糖[7]。從天然植物中尋找安全性高、副作用小的潛在功能成分成為食品營養健康的研究熱點[8]。

咖啡酰奎寧酸類化合物是植物體內重要的次生代謝產物，具有抗氧化、抗菌消炎、降血糖、降血壓等多種生物學活性[9]。研究表明咖啡酰奎寧酸類化合物能夠通過改善胰島素抵抗及調節人體對葡萄糖的吸收起到降血糖的作用[10?11]，可用于治療II 型糖尿病，但該類化合物治療II 型糖尿病的主要有效成分、作用靶點和作用機制尚不清楚。

網絡藥理學融合了計算機科學、生物學、藥理學等多個學科，通過生物網絡模型分析活性成分-靶點-疾病間復雜的互作關系，可揭示活性成分與機體相互作用機制[12]。分子對接是依據酶的鎖-鑰匙原理，從已知結構的化合物及蛋白出發，通過計算機模擬、化學計量學計算，識別并預測受體-配體結合的方法，預測蛋白質復合物結構和結合位點[13?14]。計算機輔助技術為研究藥用植物治療疾病多成分、多靶點、多途徑效應機制提供了便利。本研究基于網絡藥理學方法，預測咖啡酰奎寧酸類化合物作用靶點及作用機制，為II 型糖尿病的臨床飲食干預治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 咖啡酰奎寧酸類化合物對應靶點預測

通過PubChem 及ChemDraw Ultra 8.0.3 軟件獲取咖啡酰奎寧酸類化合物的SMILES 結構，將化合物的SMILES 結構分別輸入SwissTargetPrediction數據庫，獲取化合物的預測靶點信息。

1.2 II 型糖尿病相關靶點的檢索

通過Pubmed、Ctd、DrugBank 及Genecards 等數據庫檢索II 型糖尿病英文名“type II diabetes”，獲得與II 型糖尿病相關的作用靶點，將所得靶點去除重復項后得到II 型糖尿病相關靶點。

1.3 咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的關鍵靶點網絡構建

將“1.1”所得咖啡酰奎寧酸類化合物對應靶點與“1.2”所得II 型糖尿病相關靶點進行交集，得到交集靶點，獲取咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的作用靶點。將交集靶點通過STRING 數據庫構建蛋白互作用（PPI）網絡，通過Cytoscape 構建咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的關鍵靶點網絡。

1.4 GO 功能分析及KEGG 通路富集分析

借助WebGestalt 數據庫對關鍵靶點進行GO功能分析，其包括對生物過程（biological processes，BP）、細胞組分（cell component，CC）及分子功能（molecular function，MF）的分析。利用Cytoscape軟件中的ClueGo 插件對關鍵靶點進行KEGG 通路富集分析，選取富集基因數排名前20 的通路，通過omicshare 數據庫繪制氣泡圖。

1.5 分子對接

采用AutoDock Vina 軟件對咖啡酰奎寧酸類化合物治療Ⅱ型糖尿病中前3 的靶點蛋白與關鍵成分進行分子對接驗證。通過RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）數據庫獲取靶點蛋白晶體結構，再利用AutoDock 對接軟件對蛋白晶體結構去水加氫、計算電荷、去除原配體，對配體分子通過Torsion Tree 進行調整，運用AutoDock Vina 軟件計算其對接活性位點、結合能及均方根偏差（RMSD），最后將對接結果進行可視化分析。

2 結果與分析

2.1 咖啡酰奎寧酸類化合物對應靶點預測

咖啡酰奎寧酸類化合物是由奎寧酸和不同數目的咖啡酰基通過酯化反應縮合而成，根據咖啡酰基結合數目的不同，可分為單咖啡酰奎寧酸、二咖啡酰奎寧酸和多咖啡酰奎寧酸[15]。天然植物中提取分離得到的咖啡酰奎寧酸通常是以上述化合物共存的形式存在，天然植物藥理活性的發揮得益于其同分異構體的同時存在。該類化合物主要含有酯鍵、不飽和雙鍵、鄰二酚羥基、羥基等，尤其是酚羥基具有很好的清除自由基的能力，有助于降糖活性的發揮[16]。現已知咖啡酰奎寧酸類化合物共38 個，利用SwissTarget-Prediction 數據庫預測獲得化合物的對應靶點有483個。通過Cytoscape 軟件對上述活性化合物與預測靶點進行關系網絡的繪制和分析，得到“咖啡酰奎寧酸類化合物-靶點”網絡圖，如圖1所示。38 種咖啡酰奎寧酸類化合物網絡靶點分析順序如下：1-O-咖啡酰奎寧酸（C1）、3-O-咖啡酰奎寧酸（C2）、4-O-咖啡酰奎寧酸（C3）、5-O-咖啡酰奎寧酸（C4）、3-O-咖啡酰奎寧酸甲酯（C5）、3-O-咖啡酰奎寧酸乙酯（C6）、3-O-咖啡酰奎寧酸丁酯（C7）、4-O-咖啡酰奎寧酸甲酯（C8）、4-O-咖啡酰奎寧酸丁酯（C9）、5-O-咖啡酰奎寧酸甲酯（C10）、5-O-咖啡酰奎寧酸丁酯（C11）、1,3-O-二咖啡酰奎寧酸（C12）、1,4-O-二咖啡酰奎寧酸（C13）、1,5-O-二咖啡酰奎寧酸（C14）、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸（異綠原酸A）（C15）、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸（異綠原酸B）（C16）、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸（異綠原酸C）（C17）、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸甲酯（C18）、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸甲酯（C19）、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸甲酯（C20）、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸乙酯（C21）、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸丁酯（C22）、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸丁酯（C23）、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸異丁酯（C24）、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸乙酯（C25）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-（4-蘋果酰）-奎寧酸（C26）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-（4-蘋果酸甲酯）-奎寧酸（C27）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-（4-丙二酰）-奎寧酸（C28）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-琥珀酰奎寧酸（C29）、1,5-O-二咖啡酰-4-O-琥珀酰奎寧酸（C30）、1,5-O-二咖啡酰-4-O-琥珀酸甲酯奎寧酸（C31）、1,4-O-二咖啡酰-3-O-琥珀酰甲酯奎寧酸（C32）、1,3-O-二咖啡酰-4-O-蘋果酰奎寧酸（C33）、1,3,5-O-三咖啡酰奎寧酸（C34）、1,4,5-O-三咖啡酰奎寧酸（C35）、3,4,5-O-三咖啡酰奎寧酸（C36）、3,4,5-O-三咖啡酰奎寧酸甲酯（C37）、1,3,4,5-O-四咖啡酰奎寧酸（C38）。

圖1 “咖啡酰奎寧酸類化合物-靶點”網絡圖Fig.1 Network diagram of "caffeoylquinic acids-target"

2.2 II 型糖尿病相關靶點的檢索

通過檢索Pubmed、Ctd、DrugBank 及Genecards等數據庫共獲得II 型糖尿病相關靶點2214 個。

2.3 咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的關鍵靶點網絡構建

將咖啡酰奎寧酸類化合物的潛在作用靶點與II 型糖尿病相關靶點取交集，共得到211 個交集靶點，作為咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的作用靶點。借助STRING 數據庫及Cytoscape 軟件的MCODE 插件共篩選出37 個關鍵靶點，并繪制出咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的關鍵靶點網絡，如圖2所示。此網絡包括37 個關鍵靶點，518 條相互關系，其中節點越大表明其在網絡中的作用越大[17]，由此推斷AKT1、MMP2、MMP8、HIF1A、IGF1R、MAPK8 等靶點蛋白可能在II 型糖尿病的治療中起關鍵作用。

圖2 咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的關鍵靶點網絡Fig.2 Key target network of caffeoylquinic acids in the treatment of type II diabetes

咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的37 個關鍵靶點信息如表1所示。從表1可以看出，這些靶點與細胞的增殖分化、基因的轉錄調節、蛋白質磷酸化等生物學功能及調控葡萄糖代謝、調節胰島素受體等生物過程密切相關。糖尿病發病涉及體內多個生物過程的異常，咖啡酰奎寧酸類化合物可能是通過多靶點、多通路調節這些生物過程來發揮其抗糖尿病作用。

表1 咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的37 個關鍵靶點信息表Table 1 37 key targets information table of caffeoylquinic acids in the treatment of type II diabetes

續表1

2.4 GO 功能分析及KEGG 通路富集分析

對37 個關鍵靶點進行GO 功能分析，分析結果如圖3所示。結果顯示這些靶點主要參與代謝過程（metabolic process）、應激反應（response to stimulus）、生物調節（biological regulation）等生物過程，涉及細胞膜（membrane）、細胞核（nucleus）、腔上包膜（membrane-enclosed lumen）等細胞組成，以及蛋白結合（protein binding）、離子結合（ion binding）、轉移酶活性（transferase activity）等分子功能。

圖3 咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的關鍵靶點GO 分析Fig.3 GO analysis of key targets of caffeoylquinic acids in the treatment of type II diabetes

對37 個關鍵靶點進行KEGG 通路富集分析，富集基因數排名前20 的信號通路如圖4所示。結果表明咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的作用機制主要涉及細胞外基質降解（Degradation of the extracellular matrix）、基質金屬蛋白酶的激活（Activation of Matrix Metalloproteinases）、膠原蛋白降解（Collagen degradation）、MyD88 獨立TLR3/TLR4 級聯（MyD88-independent TLR4 cascade）等多條通路，主要涉及AKT1、MMP3、MMP9、HIF1A、IGF1R、MAPK8 等靶點基因，這些基因主要通過調控葡萄糖代謝以及調節相關蛋白質發揮作用。與通路相關的基因如表2所示，通路與其相關靶點之間的相互關系如圖5所示。

圖4 咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的關鍵靶點KEGG 通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of key targets of caffeoylquinic acids in the treatment of type II diabetes

結合表2與圖5可以看出，細胞外基質降解（Degradation of the extracellular matrix）主要涉及CASP3、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、PLG 共7 個靶點蛋白，其中CASP3 是caspase 級聯激活下游的關鍵成分，可防止細胞因子誘導的β細胞凋亡，這可能有助于保護糖尿病患者免受β細胞死亡[18]；MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9 主要通過降解多種細胞外基質及相關蛋白發揮作用；PLG 則可以調控細胞增殖。基質金屬蛋白酶的激活（Activation of matrix metalloproteinases）信號通路與膠原蛋白降解（Collagen degradation）信號通路同樣涉及MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9 等靶點，表明MMPS 靶點在咖啡酰奎寧酸類化合物抗Ⅱ型糖尿病方面發揮著極其重要的作用。MyD88-independent TLR4 cascade 信號通路則主要涉及CASP8、MAPK1、MAPK14、MAPK3、MAPK8 靶點。MAPK 是一組能被不同的細胞外刺激，如激素、神經遞質、細胞因子、細胞應激等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，調控細胞的生長、存活及分化、對環境的應激適應、炎癥反應等多種細胞生理病理過程[19]。MAPK 在炎癥條件下還可以激活與胰島素抵抗密切相關的JNK 通路和P38 通路，進而發揮治療糖尿病的作用[20]。綜上所述，一條信號通路可涉及多個基因靶點，一個基因靶點可參與多個信號通路，證實了咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病是一個涉及多靶點、多通路的復雜過程。

表2 KEGG 通路富集分析相關基因Table 2 Related genes for KEGG pathway enrichment analysis

圖5 咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的作用通路與其相關靶點網絡分析Fig.5 Network analysis of the pathways of caffeoylquinic acids in the treatment of type II diabetes and their related targets

2.5 分子對接驗證

為了驗證咖啡酰奎寧酸類化合物預測靶點的準確性，本研究采用AutoDock Vine 軟件對3 個關鍵成分和3 個靶點進行分子對接，以自由結合能（binding energy）作為篩選條件，結合能越小表示對接結果越好。對于多構象的對接結果，篩選出結合能最低的對接構象，如表3所示。化合物與分子靶點對接得分均大于5.0，表明分子對接結果良好，驗證了網絡構建預測的準確性。運用Pymol 軟件，根據結合能的大小選出每個靶點蛋白對接最好的化合物進行可視化分析，結果如圖6所示，其中IGF1R 與綠原酸、JAK1 與異綠原酸A 和RPS6KB1 與1,3,5-O-三咖啡酰奎寧酸均可以形成氫鍵，為進一步整合探析咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病提供了理論參考。

圖6 IGF1R、JAK1、RPS6KB1 與3 個關鍵成分的最佳對接構象Fig.6 Optimal docking conformation of IGF1R,JAK1,RPS6KB1 and the three key components

表3 3 個靶點與3 個關鍵成分的分子對接得分Table 3 Molecular docking scores of 3 targets and 3 key components

3 討論

本研究基于網絡藥理學的方法，借助相關數據庫和軟件對咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的作用靶點及作用機制進行了全面系統的分析。研究結果顯示，通過分析得出咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的關鍵靶點有37 個，靶點與靶點之間的相互關系達518 條。其作用機制主要涉及細胞外基質降解、基質金屬蛋白酶的激活和膠原降解等通路、主要涉及AKT1、MMP3、MMP9、HIF1A、IGF1R、MAPK8 等靶點，與目前研究的某些藥物作用于II 型糖尿病的靶點、通路基本相符[21?24]，驗證了咖啡酰奎寧酸類組分具有多成分、多靶點、多通路的特點。

王馨苑等[25]通過網絡藥理學結合分子對接研究了黃連素治療II 型糖尿病的作用機制，結果顯示黃連素能夠通過與AKT1、MMP9 等核心靶點的穩定結合，起到治療II 型糖尿病的作用。在機體組織缺氧時，可激活缺氧誘導因子HIF-1α，而HIF-1α表達的增多會進一步加重神經纖維的缺血缺氧，這可能為糖尿病周圍神經病變的發病機制之一[26]。呂翠巖等[27]研究發現抑制糖尿病周圍神經病變大鼠坐骨神經HIF-1αmRNA 的轉錄和蛋白的表達，可以達到治療糖尿病的效果。MAPK 信號通路為胰島素信號的級聯通路，其可以通過多種途徑調節肝臟代謝，還可以通過上調GLUT4 的表達，促進糖的吸收與利用，增加胰島素敏感性和改善胰島素抵抗，與葡萄糖穩態有密切的關系[28?29]。葛凌等[30]研究發現槲皮素可有效減輕大鼠外周胰島素抵抗，其作用機制可能是槲皮素激活了胰腺組織中FGF21/MAPK 信號通路，證實了MAPK 信號通路在治療II 型糖尿病中的作用。Li 等[31]研究發現糖尿病大鼠心肌存在明顯心肌纖維化，通過硫化氫（H2S）干預后，糖尿病大鼠心肌纖維化明顯減輕，心肌組織中膠原蛋白I 的表達水平顯著下降，且MMP-8 蛋白表達水平也明顯降低，而MMPs 的表達受MAPK 通路的調控[32]，表明H2S 改善糖尿病大鼠心肌纖維化與膠原蛋白降解以及MAPK 信號通路有關。這些研究報道表明通過網絡藥理學預測咖啡酰奎寧酸類化合物的作用靶點和通路具有可行性，證實了咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病具有多靶點、多通路的特點，這是傳統“一藥一靶點”模式難以做到的，而這也符合中藥多成分、多靶點、多通路對疾病起到綜合治療作用的特點。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法預測了咖啡酰奎寧酸類化合物治療II 型糖尿病的作用靶點及作用機制，闡明該類成分通過多靶點、多通路治療II 型糖尿病，為進一步實驗研究和臨床應用提供了新思路、指明了新方向。但是網絡藥理學分析也存在一定的局限性，其雖然能較為系統地預測活性成分作用靶點與作用通路，但預測結果不能完全證明其正確性，其作用機制需要開展體外和體內實驗進行驗證。