芋頭球蛋白的提取純化及其對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

馬二蘭，林 瑩，涂 連，張 帆，王偉良

（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧 530004）

芋頭（Colocasia esciclenta（L.）Schott）又稱芋魁，俗名芋艿，天南星科魁芋屬多年生草本傳統藥食兩用植物[1]，世界各地均有種植，其中廣西荔浦芋較為出名，荔浦芋又名檳榔芋，個頭大、產量高、營養物質豐富。芋頭球蛋白分為G1 和G2 兩種，各占可溶性蛋白的40%左右，一種凝集素Tarin，具有獨特的碳水化合物結合特性，芋頭的很多活性與其相關，另一種為蛋白酶抑制劑的Kunitz 家族，氨基酸測序證實其與胰蛋白酶抑制有關[2]。比如研究者發現中國臺灣的檳榔芋蛋白經胃蛋白酶酶解后具有抗氧化活性和血管緊張素轉換酶抑制作用[3]，芋頭蛋白具有抗氧化[4]、調節免疫[3]、抗腫瘤和抗菌生長的能力[5]等活性。芋頭蛋白提取工藝研究較少，芋頭中活性蛋白一般采用含鹽緩沖液提取，將芋頭40 ℃以下烘干打粉[3]或將新鮮芋頭打漿[6]，4 ℃提取，硫酸銨鹽析即可分離出蛋白質，童晶晶等[7]比較了幾種提取溶劑，發現鹽提蛋白胰蛋白酶抑制活性最高，黃友如等[8]采用分級提取Osborne 分級法芋艿蛋白，其中清蛋白的提取率為43.38%。本文采用0.1 mol/L 磷酸緩沖液（含0.3 mol/L NaCl，pH=6.8）的方法提取芋頭球蛋白，芋頭球蛋白占可溶性蛋白的80%左右，且文獻[2]中報道的酶抑制活性與球蛋白有關，因此可初步認為本研究提取純化所得活性蛋白即為球蛋白。

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶能催化水解淀粉和低聚糖，引起餐后血糖升高[9?10]。Kumari 等[11]提取純化芋頭蛋白，發現其能非競爭性抑制α-淀粉酶，70 ℃仍然保留較高活性，最適pH6.9，有研究表明塊莖植物中抑制α-淀粉酶抑制活性蛋白也能抑制α-葡萄糖苷酶[12]，分子量一般為11～25 kDa 之間[13]，與芋頭中球蛋白的分子量相近，因此猜測芋頭球蛋白也有抑制活性，Sharma 等[14]從芋頭中提取純化得到兩種α-淀粉酶抑制活性蛋白，能抵抗蛋白酶的酶解，與Mcewan等[13]發現芋頭蛋白一樣對α-淀粉酶抑制作用為選擇性抑制。

芋頭功能和營養特性已經研究了半個世紀，芋頭蛋白具有一定的生物活性[1]，國內對蛋白類α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑提取工藝研究較少，而國外研究了芋頭蛋白對α-淀粉酶抑制活性卻對提取工藝沒有對比與優化。因此，本文采用磷酸緩沖液提取芋頭球蛋白，優化提取工藝，經DEAE-52 離子纖維素柱層析純化得到高活性組分，高效液相檢測純度，SDS-PAGE 電泳測分子量，測等電點，研究其對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性以評價其體外血糖調節活性，并通過酶抑制動力學初步研究作用機理，為進一步分析活性蛋白的結構和理化性質、研究其體內調節血糖活性奠定基礎，有望指導功能食品的研發，提高芋頭產品附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮廣西荔浦芋頭 于秋末采摘自南寧百貨超市；豬胰腺α-淀粉酶（9 U/mg）、阿卡波糖（500 mg）A9281 北京索萊寶科技有限公司；酵母α-葡萄糖苷酶（50 U/mg） 南京都萊生物技術有限公司；可溶性淀粉 廣州光華科技股份有限公司；對硝基苯-α-D-葡萄糖苷 上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑

均為國產分析純；實驗用水 均為二級水。

Infinite M200 pro 酶標儀 奧地利TECAN 公司；KND 系列凱氏定氮儀和消化爐 浙江托普云農科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芋頭蛋白的提取

1.2.1.1 芋頭蛋白的提取工藝 提取工藝[15]：挑選完好、新鮮的芋頭洗凈去皮，切成1 cm3小塊，按料液比1:15 mg/mL（干基）加入含0.3 mol/L 氯化鈉的0.1 mol/L 磷酸緩沖液，于榨汁機中勻漿5 min，35 ℃恒溫水浴提取2 h，4℃下5000 r/min 離心15 min，上清液置于冰浴中，緩慢加入硫酸銨至80%飽和度，邊加邊輕輕攪拌，避免局部高濃度硫酸銨引起蛋白變性，離心得蛋白沉淀，溶于10 倍體積的磷酸緩沖液，輕輕搖勻使溶解充分，所得蛋白液轉入截留分子量3500 kDa 的透析袋中，置于裝有蒸餾水的大燒杯在4 ℃冰箱透析36 h，每6 h 換一次水，凍干得粗蛋白粉。芋頭總蛋白含量和粗蛋白中的總蛋白含量測定參照GB 5009.5-2016 中凱氏定氮法，提取蛋白含量采取考馬斯亮藍法[16]，以牛血清白蛋白為標準品制作標準曲線，蛋白質標曲為y=0.2019x+0.0037（R2=0.9995，其中x 為吸光度，y 為蛋白濃度）。蛋白質提取率、得率和純度計算公式如下[17]：

1.2.1.2 芋頭蛋白提取工藝單因素實驗 設定基本條件為料液比1:15 g/mL，溫度35 ℃，提取時間2 h，次數2 次，改變其中一個條件，分別考察各因素對蛋白提取率的影響[18]：料液比取1:5、1:7.5、1:10、1:12.5、1:15、1:17.5、1:20 （g/mL），溫度取25、30、35、40、50、60、70 ℃，提取時間取30、60、90、120、150、180 min，次數取1、2、3、4 次。

1.2.1.3 響應面優化芋頭蛋白提取工藝 選取料液比、提取溫度和提取時間為因素，以蛋白質提取率為響應值，設計Box-Behnken 試驗[19]，每組重復3 次，因素及水平如表1。

表1 響應面試驗因素和水平Table 1 Independent variables and their coded levels used in response surface methodology

1.2.2 芋頭蛋白的純化 采用DEAE-52 纖維素離子交換層析柱[20]對芋頭蛋白進行初步純化。填料按照說明書中方法處理好，裝入層析柱（2.6 cm×50 cm）自然沉降，關柱調節流速至0.3 mL/min 平衡12 h，上樣5.0 mL 濃度40 mg/mL 的芋頭蛋白質溶液，待蛋白質溶液與填料上端平齊后，關柱，靜置吸附1 h，以含氯化鈉濃度0、0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L 的磷酸緩沖液洗脫，流速0.2 mL/min，15 min/管，40 管/組。分部收集器收集洗脫液，測OD280制作洗脫曲線，合并洗脫液，透析，冷凍干燥得純化后的芋頭球蛋白。

采用高效凝膠排阻色譜（GPC）[21]測蛋白質純度，色譜條件：色譜柱SB-804HQ；流動相5%甲醇；檢測波長280 nm；柱溫度25 ℃；流速0.5 mL/min。

1.2.3 芋頭球蛋白等電點和SDS-PAGE 電泳分析

1.2.3.1 芋頭蛋白等電點的測定 參考文獻[22]將芋頭球蛋白配成1.0 mg/mL 溶液，用不同濃度醋酸溶液配成不同pH 的溶液5.0 mL 于15 mL 離心管中，加入1.0 mL 蛋白溶液，4℃靜置1 h 后5000 r/min離心15 min，測上清液蛋白質濃度，濃度最低說明沉淀量最大，即為等電點。

1.2.3.2 芋頭蛋白SDS-PAGE 電泳分析 配制1.0 mg/mL 蛋白質溶液，加入4 倍非還原上樣緩沖液，混勻后1000 r/min 離心5 min，參考文獻[23]采用SDS-PAGE 電泳法，配制5%濃縮膠、12%分離膠，蛋白上樣量10 μL，80 V 電泳至濃縮膠與分離膠的分界線處，改為120 V 繼續電泳至分離膠底部，考馬斯亮藍染色30 min，快速脫色液脫色，凝膠成像系統拍照、分析電泳條帶。

1.2.4 芋頭球蛋白對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制動力學研究

1.2.4.1 芋頭球蛋白對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性測定 確定最佳反應時間和α-淀粉酶濃度，使酶反應的速率在0.03～0.25 ΔA/min 之間[24]。α-淀粉酶抑制活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法[25]，將0.25 mL 的α-淀粉酶移入25 mL 具塞試管，加入0.25 mL 酶液，0.25 mL 的蛋白質溶液，陽性對照以同體積1.0 mg/mL 阿卡波糖代替，37 ℃預熱10 min，加入10 mg/mL 的可溶性淀粉3.25 mL，水浴振蕩反應10 min 后立即加入1.5 mL DNS 終止反應，沸水浴5 min，流水冷卻，蒸餾水定容至25 mL，空白組及對照組以同體積PBS 代替，酶標儀測540 nm 處吸光度。α-葡萄糖苷酶抑制活性采用4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）比色法[26]，反應體系采用96 孔板法，加入120 L PBS，20 μL 樣品溶液，陽性對照以同體積1.0 mg/mL 阿卡波糖代替，20 μL 0.3 U/mL的α-葡萄糖苷酶，37 ℃預熱10 min，加20 μL 2.5 mmol/L pNPG 反應30 min，加1.0 mol/L 碳酸鈉終止反應，測410 nm 處吸光度，抑制率公式如下。

1.2.4.2α-淀粉酶活性抑制動力學研究 參考文獻[27]方法稍有改動，不同酶濃度（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mg/mL）下測定球蛋白作用下的反應速率，繪制反應動力學曲線。固定酶濃度為0.5 mg/mL，測定不同底物濃度2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL 時芋頭球蛋白作用下的反應速率，作雙倒數曲線判斷抑制類型，求抑制常數Ki。

1.2.4.3α-葡萄糖苷酶活性抑制動力學研究 參考文獻[28]方法稍有改動，不同酶濃度（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 U/mL）下測球蛋白作用下的反應速率，繪制反應動力學曲線。測不同pNPG 濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L 時的反應速率，作雙倒數曲線判斷抑制類型，求抑制常數Ki。

1.3 數據處理

所有實驗均進行3 次平行實驗，數據采用平均值±標準差的形式，采用Design-Expert8.0.6 軟件、SPSS17.0、Excel2010 和Origin8.0 軟件分析處理數據。

2 結果與分析

2.1 芋頭蛋白的提取

2.1.1 單因素實驗 如圖1，隨著料液比的提高，蛋白質提取率先增加后趨于穩定，因為料液比的提高可以增加原料與提取溶劑的接觸面積，促進蛋白質溶出，但料液比超過1:15 g/mL 后，不僅會增加雜質溶出，溶液中鹽離子增多可能使蛋白變性，且導致蛋白濃度過低不利于后續的鹽析，因此選取1:15 g/mL為宜。如圖2，溫度對蛋白質的提取率影響較大，低于25 ℃不利于蛋白質溶出，高于60 ℃可能引起淀粉糊化而包裹住蛋白質阻礙其溶出，40 ℃之前提取率隨溫度急劇變化，之后趨于穩定，70 ℃時提取率降低，可能是因為淀粉糊化包裹蛋白在離心時除去，為保證活性和提取率選取40 ℃作為提取溫度。如圖3，蛋白質提取率隨提取時間先增加后降低，蛋白質的提取率與時間密切相關，時間少于60 min 時蛋白質沒有充分溶出，導致提取不夠充分，而時間超過150 min 蛋白質可能會變性沉淀而在離心中除去，因此，選取120 min 作為提取時間。如圖4，提取2 次以后，蛋白質提取率增加變緩慢，表明大部分蛋白質已充分提取，因此，選取2 次作為提取次數。

圖1 料液比對芋頭球蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction yield of taro globulin

圖2 溫度對芋頭球蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the taro globulin extraction rate

圖3 時間對芋頭球蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on taro globulin extraction rate

圖4 次數對芋頭球蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction times on taro globulin extraction rate

2.1.2 響應面優化芋頭蛋白提取工藝 根據Box-Benhnken 設計試驗，結果見表2。使用Design Expert 8.0.6 分析和擬合后得芋頭蛋白的提取率（Y）對料液比（A）、提取溫度（B）和提取時間（C）的二次多項式回歸模型：

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response urface methodology

Y(%)=36.62+1.20A+0.51B+0.94C?0.18AB?0.36AC?0.20BC?2.70A2?0.36B2?1.10C2

如表3進行顯著性分析，模型回歸P<0.0001，失擬項0.0662>0.05，表明殘差由隨機誤差引起，模型復決定系數R2=0.9971，所以模型可解釋99.71%的響應值變化，模型校正決定系數R2Adj=0.9933，與R2接近，表明模型具有充分性和準確性。由表中F值可知三因素對提取率的影響：A>C>B，即料液比>提取時間>提取溫度，一次項A、B、C，交互項AC 和二次項A2、B2、C2極顯著（P<0.01）；交互項BC 顯著（P<0.05）；其他均不顯著。

由圖5反映的是第三個因素處于零水平判斷另外兩個因素的交互作用，隨料液比和溫度的增加，提取率先提高后降低，提取率隨溫度的變化幅度小于料液比，交互作用不顯著；隨料液比和提取時間的增加，提取率先提高后降低，在幾何中心點達到最大，交互作用顯著，隨提取時間和提取溫度，提取率在溫度提高時變化不大，隨提取時間增加提取率快速提高后趨于平緩，兩者的交互作用較顯著，這與表3中AC 的交互作用最顯著一致，即料液比和時間對提取率的交互影響最大。最優提取條件的確定及驗證：將回歸方程對A、B、C 分別取一階偏導數等于零，得到最佳條件為料液比15.67:1 mL/g、溫度41.33 ℃、時間124 min，此時的提取率為36.88%±0.25%，考慮實際操作將其修正為料液比16:1 mL/g、溫度41 ℃、時間124 min，為驗證響應面試驗的準確性，重復實驗3 次，得提取率為36.75%±0.31%，和預測值吻合良好，表明此模型可用。童晶晶[15]采用鹽提法提取香芋蛋白，提取率為55.68%，常銀子等[29]采用酶法提取芋艿分離蛋白的提取率為10.20%，芋頭蛋白的提取率與芋頭品種和提取方法有關，本研究蛋白提取率相對較高，可用于活性蛋白的提取。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model

圖5 各因素交互作用響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the interaction of various factors

2.2 芋頭蛋白的純化

由圖6和表4可知，芋頭粗蛋白經DEAE-52 纖維素層析柱后得四個洗脫組分，其中0.1 mol/L 氯化鈉洗脫組分蛋白含量最高，由含量可求出得率為0.20%±0.01%，且活性最高，可作為活性蛋白進一步研究。

圖6 DEAE-52 纖維素層析柱純化芋頭球蛋白洗脫曲線Fig.6 Elution curve of taro globulin purified by deae-52 ion exchange chromatography

表4 DEAE-52 纖維素柱層析不同鹽濃度洗脫組分的蛋白質含量和酶抑制活性Table 4 Protein content and enzyme inhibitory activity of elution components with different salt concentrations on DEAE-52 cellulose column chromatography

由圖7和表5可知，芋頭蛋白純化洗脫曲線中共有4 個吸收峰，在20.078 min 處有一主峰，經計算得該峰對應蛋白的純度為93.27%，表明蛋白純化效果較好。

表5 芋頭蛋白提取率和純度Table 5 Extraction rate and purity of taro protein

圖7 芋頭球蛋白經純化在HPLC 流出曲線Fig.7 Taro globulin HPLC outflow curve after purified

2.3 芋頭蛋白等電點和SDS-PAGE 電泳分析

2.3.1 芋頭蛋白等電點的測定 如圖8，pH=5.6 時上清液蛋白濃度最低，說明此時蛋白沉淀量最大，即為芋頭球蛋白等電點，在Damares 等測得的芋頭球蛋白G1 等電點（pI）為5.5～9.5 內[30]。

圖8 上清液球蛋白濃度隨pH 變化曲線Fig.8 Curve of globulin concentration in supernatant with pH

2.3.2 芋頭蛋白SDS-PAGE 電泳分析 如圖9所示，芋頭粗蛋白分子量為12、22、40、55 和63 kDa，純化后得到電泳純的球蛋白，分子量為22 kDa 左右，與文獻[2]中具有蛋白酶抑制活性的芋頭球蛋白的分子量一致。Sharma 等[14]提取純化得到的兩種具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白的分子量為14.3 和12.5 kDa，文獻[30]中報道的一種芋頭球蛋白也由12.5 kDa 的同型亞基組成，其與很多活性有關。童晶晶[15]比較了不同提取溶劑的分子量，發現Tris提取物所含條帶最多，胰蛋白酶抑制活性最強，表明一定濃度的緩沖液能促進蛋白溶出且蛋白種類保留率高，本文采用的磷酸緩沖液提取的蛋白條帶也較多，說明可用于活性蛋白的提取。

圖9 芋頭球蛋白電泳圖Fig.9 Electropherogram of taro globulin

2.4 芋頭球蛋白對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制動力學研究

2.4.1α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定 由圖10、圖11可知，隨著芋頭球蛋白濃度增加，其對兩種酶的抑制活性均增強，且呈良好的量效關系。利用SPSS 軟件求出芋頭球蛋白對α-淀粉酶的IC50為（0.75±0.10） mg/mL，對α-葡萄糖苷酶的IC50為（2.09±0.19） mg/mL，阿卡波糖對α-淀粉酶的IC50為（0.61±0.13） mg/mL，對α-葡萄糖苷酶的IC50為（0.69±0.16） mg/mL。芋頭球蛋白對α-淀粉酶的抑制活性與阿卡波糖相當，而對α-葡萄糖苷酶抑制活性低于阿卡波糖。

圖10 芋頭球蛋白和阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制作用Fig.10 Inhibitory effects of taro globulin and acarbose on α-amylase

圖11 芋頭球蛋白和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.11 Inhibitory effects of taro globulin and acarbose on α-glucosidase

2.4.2 芋頭球蛋白對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制動力學研究 參照文獻[27,31]能夠確定芋頭球蛋白對α-淀粉酶的抑制作用類型，由抑制動力學曲線圖12、圖13可知，加入不同濃度蛋白時所得的直線交于原點，且隨蛋白濃度增加斜率減少，說明芋頭球蛋白對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均為可逆抑制，且圖14、圖15的Lineweaver-Burk 雙倒數曲線符合非競爭性抑制的特點，因此推測芋頭球蛋白對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶為非競爭性抑制，蛋白與酶通過形成復合物來抑制酶，該復合物阻斷活性位點或改變酶的構象，最終導致其催化活性降低，與文獻一致[11]。由表6的雙倒數曲線方程可以求得芋頭球蛋白對α-淀粉酶抑制的Ki=（0.61±0.05） mg/mL，對α-葡萄糖苷酶抑制的Ki=（0.26±0.02） mmol/L，說明芋頭球蛋白對兩種酶的抑制活性均較高。

表6 芋頭球蛋白與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶反應的Lineweaver-Burk 雙倒數曲線方程Table 6 Lineweaver-Burk plots equation of the reactions of α-amylase and α-glucosidase with taro globulin

圖12 芋頭球蛋白對α-淀粉酶的抑制動力學曲線Fig.12 Inhibitory kinetic curve of taro globulin on α-amylase

圖13 芋頭球蛋白對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學曲線Fig.13 Inhibitory kinetic curve of taro globulin on α-glucosidase

圖14 芋頭球蛋白與α-淀粉酶反應的Lineweaver-Burk 雙倒數曲線Fig.14 Lineweaver-Burk plots of the reactions of α-amylase with taro globulin

圖15 芋頭球蛋白與α-葡萄糖苷酶反應的Lineweaver-Burk 雙倒數曲線Fig.15 Lineweaver-Burk plots of the reactions of α-glucosidase with taro globulin

3 結論

芋頭不僅提供營養物質，還是天然活性物質的主要來源。本研究從芋頭中提取純化得到一種球蛋白，發現其對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均具有較高的抑制活性，存在量效關系，且純化后活性明顯提高，抑制類型均為可逆的非競爭性抑制，表明芋頭球蛋白具有一定的體外調節血糖活性，但還需進一步對球蛋白進行鑒定、研究構效關系和體內作用機制。另外，可進一步對其體內消化進行研究；或者酶解蛋白得到活性肽，對生物活性肽片段進行后續分離、純化和測序研究，應用于保健食品、食品配料或其他類型的食品。