基于主要功能成分含量的不同品種枇杷葉評(píng)價(jià)

王 洋，汪 蘭，李怡諾，龐同匯，包俊文，魯周民

（西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西楊凌 712100）

枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）葉味苦、性平無(wú)毒[1]，有抗病毒[2]、抗炎[3]、止咳化痰、抗肺纖維化、抗氧化和衰老、降血糖和血脂等作用[4]，是一味傳統(tǒng)中藥材，2014年批準(zhǔn)成為新食品原料，藥食兼用[5]。目前，有關(guān)枇杷葉功能成分及藥理作用的研究成為本領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。研究表明，葉中總黃酮成分能較好的抑制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的繁殖[6]，三萜酸類物質(zhì)具有抗氧化[7]、抗腫瘤[8?9]、降血脂[10]、止咳化痰、抑制細(xì)菌[11]以及良好的免疫調(diào)節(jié)作用，能提高機(jī)體免疫能力[12?14]。以枇杷葉為原料提取的三萜酸具有抵御EBVEA 腫瘤病毒的能力，其中2a,19a-二羥基-3-0-烏蘇酸單體具有抑制HIV 病毒活性的作用[15]，提取物科羅索酸有降血糖和調(diào)血脂作用[16]，熊果酸具有抗炎、抗腫瘤、抑菌、抗HIV 病毒、抗瘧疾等生理活性[17]。枇杷葉多糖在抗氧化、抗疲勞和免疫調(diào)節(jié)上有一定功效[18?19]。目前有關(guān)枇杷葉藥理作用研究的文獻(xiàn)幾乎為采自某處經(jīng)鑒定的枇杷葉，而針對(duì)不同品種枇杷葉的主要功能成分含量比較研究鮮見(jiàn)報(bào)道，關(guān)于生長(zhǎng)在同一地區(qū)的不同品種枇杷葉間功能成分含量差異尚不清楚。

作為加工食品、保健品或中藥材的植物原料，其質(zhì)量?jī)?yōu)劣取決于原料中關(guān)鍵成分的含量，進(jìn)而影響加工成品的品質(zhì)。在植物生長(zhǎng)過(guò)程中，功能成分含量除了受環(huán)境條件影響，在很大程度上受其本身遺傳因子的影響[20]。不同品種枇杷葉中存在較為明顯的遺傳分化現(xiàn)象，對(duì)枇杷葉中熊果酸、齊墩果酸含量有明顯影響[21]。為探明枇杷葉中主要功能成分含量在不同品種間的差異，以生長(zhǎng)在陜南安康地區(qū)的14 個(gè)品種枇杷葉為材料，分析測(cè)定了主要功能成分含量及抗氧化活性，并采用相關(guān)性分析和主成分分析法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，旨在為枇杷葉開(kāi)發(fā)利用中的品種選取提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枇杷葉 品種為‘津云’、‘西農(nóng)枇杷2 號(hào)’、‘ADVANCE’、‘白茂木’、‘福原早生’、‘森本’、‘長(zhǎng)崎早生’、‘長(zhǎng)生早生’、‘瑞穗’、‘大五星’、‘麥后黃’、‘佳伶’、‘培優(yōu)’、‘馬克’，其中‘大五星’、‘佳伶’、‘培優(yōu)’和‘馬克’為7a 生，其余品種為18a 生，采自西北農(nóng)林科技大學(xué)安康北亞熱帶經(jīng)濟(jì)林果樹(shù)試驗(yàn)示范站；水溶性VE（Trolox）（色譜純） 美國(guó)Sigma 公司；過(guò)硫酸鉀、三氯化鐵、福林-酚試劑、苯酚、濃硫酸、冰醋酸、濃鹽酸、高氯酸、香草醛、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、碳酸鈉、三水合醋酸鈉、無(wú)水乙醇、維生素C、葡萄糖、熊果酸、沒(méi)食子酸、蘆丁、2,2’-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline6-sulfonic acid） diammonium salt，ABTS）、三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）均為分析純。

DGG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；KH-500DE 型數(shù)控超聲清洗器

昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；LS 220SCS 型電子天平 瑞士普利賽斯公司；H1850 型臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；JYLC022 型料理機(jī) 九陽(yáng)集團(tuán)；UHH-S4 型恒溫水浴鍋

北京科偉永興儀器有限公司；UV-1240 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取方法 2019年5月底，每個(gè)品種選取生長(zhǎng)健康的3 棵樹(shù)，在外圍枝條下端采集老葉，每個(gè)枝條采1 片葉，每個(gè)品種共采集30 片，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室洗凈、陰干，粉碎至80 目，保存?zhèn)溆谩?zhǔn)確稱取樣品0.500 g 樣品2 份，1 份用30.0 mL 70%乙醇溶液提取，離心取上清液用于總酚、總黃酮、總?cè)扑帷BTS 陽(yáng)離子自由基清除率和FRAP 值的測(cè)定，另1 份用25.0 mL 蒸餾水提取，離心取上清液用于多糖和維生素C 的測(cè)定。共三次重復(fù)。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定方法 多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[22?23]。維生素C 含量測(cè)定采用紫外分光光度法，參考文獻(xiàn)[24?25]中方法。總黃酮含量的測(cè)定采用硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法[26]；總酚含量的測(cè)定采用福林-酚法[27?28]；三萜酸含量的測(cè)定采用香草醛-冰醋酸法[29]。抗氧化活性指標(biāo)ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率和FRAP 值的測(cè)定參考文獻(xiàn)[30?32]中的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、SPSS 26.0 軟件與Origin 2019 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，并進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P<0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用相關(guān)性分析、主成分分析法、聚類熱圖進(jìn)行枇杷葉的綜合品質(zhì)評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種枇杷葉主要成分含量分析結(jié)果

對(duì)14 個(gè)品種枇杷葉總黃酮、總酚、三萜酸、多糖、維生素C 含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。可以看出，不同品種枇杷葉中總黃酮、總酚、三萜酸含量均存在差異。‘佳伶’的葉片中總黃酮、總酚含量最高，分別為141.80 和62.50 mg/g，‘長(zhǎng)生早生’葉片中總黃酮、總酚含量最低，分別為108.66 和47.43 mg/g。‘培優(yōu)’葉片中三萜酸含量最高，為114.18 mg/g，‘佳伶’和‘麥后黃’次之，‘長(zhǎng)生早生’葉片中三萜酸含量最低，為71.61 mg/g。由表1中結(jié)果可知，‘佳伶’、‘培優(yōu)’和‘麥后黃’3 個(gè)品種枇杷葉中，總黃酮、總酚和三萜酸含量明顯高于其他品種，因此，‘佳伶’、‘培優(yōu)’和‘麥后黃’3 個(gè)品種的枇杷葉具有更好的藥用價(jià)值和功能性。

多糖和維生素C 含量在不同品種枇杷葉中均存在差異。‘西農(nóng)枇杷2 號(hào)’葉片中多糖含量高于其他品種（P<0.05），為85.36 mg/g，‘津云’次之，為79.19 mg/g，‘長(zhǎng)崎早生’最低，含量為51.66 mg/g。‘培優(yōu)’葉片中維生素C 含量最高，為2.37 mg/g，‘西農(nóng)枇杷2 號(hào)’和‘津云’次之，3 個(gè)品種葉片中維生素C 含量明顯高于其它品種。‘ADVANCE’葉片中維生素C 含量最低，為1.38 mg/g。從對(duì)不同品種枇杷葉中多糖和維生素C 含量分析結(jié)果可知，‘西農(nóng)枇杷2 號(hào)’、‘培優(yōu)’和‘津云’中多糖和維生素C 含量顯著高于其他品種，具有較好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.2 不同品種枇杷葉抗氧化活性分析結(jié)果

對(duì)14 個(gè)品種枇杷葉的抗氧化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。可以看出，對(duì)ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率和FRAP 值在不同品種枇杷葉中存在差異。‘麥后黃’枇杷葉對(duì)ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率最高，達(dá)到12.29%，‘森本’和‘福原早生’次之，3 個(gè)品種枇杷葉對(duì)ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率顯著高于‘長(zhǎng)崎早生’和‘長(zhǎng)生早生’（P<0.05），‘長(zhǎng)崎早生’的清除率最低，僅達(dá)到9.54%。FRAP 值以‘佳伶’最高，達(dá)到84.76 μmoL/L，‘麥后黃’次之，2 個(gè)品種FRAP 值顯著高于其他品種（P<0.05），而以‘長(zhǎng)生早生’的FRAP 值最低，為56.23 μmoL/L。結(jié)合表1結(jié)果，對(duì)ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率以及FRAP 值高的品種，黃酮、總酚、三萜酸含量也較高。這與廖圓圓等[33]、付曉丹等[34]對(duì)枇杷中總黃酮、總酚的體外抗氧化性能研究結(jié)果一致；與戴云等[35]對(duì)三萜酸與抗氧化性能研究結(jié)果一致。

表1 不同品種枇杷葉中總黃酮、總酚、三萜酸、多糖、維生素C 含量（mg/g）Table 1 Contents of total flavonoids,total phenols,triterpenoid acids,polysaccharide and vitamin C in loquat leaves of different varieties (mg/g)

表2 不同品種枇杷葉抗氧化性Table 2 Antioxidant capacity of loquat leaves of differentvarieties

2.3 相關(guān)性分析

對(duì)14 個(gè)品種枇杷葉主要成分含量以及抗氧化性能7 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表3所示。可以看出，在枇杷葉中總黃酮、總酚和三萜酸含量3 個(gè)指標(biāo)間呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P<0.01），表明在這3 個(gè)指標(biāo)數(shù)據(jù)含量間關(guān)聯(lián)性較大。枇杷葉中多糖和維生素C 含量呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P<0.01），相關(guān)系數(shù)為0.733。FRAP 值表示枇杷葉對(duì)鐵離子的還原力，數(shù)值越大表明抗氧化能力越強(qiáng)。結(jié)果表明，F(xiàn)RAP 值與枇杷葉總黃酮含量、總酚含量、三萜酸含量呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P<0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.835、0.763、0.878；ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率和FRAP 值呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為0.539。表明枇杷葉的抗氧化活性主要來(lái)源于總黃酮、總酚和三萜酸3 種成分的含量。

表3 各測(cè)定指標(biāo)相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of each measurement index

2.4 主成分分析結(jié)果

對(duì)14 個(gè)品種枇杷葉樣本5 個(gè)主要成分和2 種抗氧化值共7 個(gè)功能指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)表4、表5。

表4 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 4 Eigenvalue and variance contribution rates

表5 因子負(fù)荷矩陣Table 5 Component matrix

根據(jù)特征值大于1.0 的原則，提取前2 個(gè)主成分，其累計(jì)貢率80.154%，這2 個(gè)指標(biāo)可以表現(xiàn)原有指標(biāo)的大部分信息。其因子負(fù)荷矩陣和旋轉(zhuǎn)后因子載荷矩陣見(jiàn)表5。

旋轉(zhuǎn)后第1 主成分（PC1）主要受總黃酮、總酚和三萜酸含量以及FRAP 值的正向影響，即PC1 越大，以上指標(biāo)越大；第2 主成分（PC2）主要受多糖、維生素C 的正向影響。

按照2 個(gè)主成分的大小依次排序，可以比較直觀地判斷出每個(gè)因子在各品種中的重要性。根據(jù)主成分歸類，計(jì)算14 個(gè)品種枇杷葉的綜合得分，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同品種枇杷葉品質(zhì)預(yù)測(cè)評(píng)價(jià)結(jié)果Table 6 Prediction and evaluation results of loquat leaf quality of different varieties

可以看出，14 個(gè)枇杷品種中因子PC1 得分前3 名排序?yàn)椤蚜妗?‘麥后黃’>‘培優(yōu)’；因子PC2 得分前3 名排序?yàn)椤鬓r(nóng)枇杷2 號(hào)’>‘津云’>‘白茂木’。

主成分綜合方程：F 綜=0.55F1+0.25F2。在主成分分析得出的結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)主成分綜合得分方程計(jì)算不同品種枇杷葉的綜合得分。綜合排名從1 到14 的品種依次為‘佳伶’、‘麥后黃’、‘培優(yōu)’、‘瑞穗’、‘福原早生’、‘白茂木’、‘西農(nóng)枇杷2 號(hào)’、‘津云’、‘森本’、‘馬克’、‘大五星’、‘ADVANCE’、‘長(zhǎng)崎早生’、‘長(zhǎng)生早生’。

2.5 聚類熱圖分析結(jié)果

根據(jù)14 個(gè)品種枇杷葉7 個(gè)指標(biāo)的測(cè)定數(shù)據(jù)，通過(guò)聚類分析，得出聚類熱圖，見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)14 個(gè)品種枇杷葉7 項(xiàng)指標(biāo)呈現(xiàn)出一定的聚類性特征，在歐氏距離2 處指標(biāo)可以劃分為2 類：第Ⅰ類為總黃酮、總酚、三萜酸、FRAP 值、ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率，為主要功能性指標(biāo)，5 項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性較強(qiáng)。第Ⅱ類為多糖、維生素C，為主要營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)。在歐氏距離1 處可以將14 個(gè)品種枇杷葉劃分為4 類：第Ⅰ類為‘培優(yōu)’、‘佳伶’、‘麥后黃’；第Ⅱ類為‘長(zhǎng)生早生’；第Ⅲ類為‘馬克’、‘大五星’、‘森本’、‘長(zhǎng)崎早生’、‘ADVANCE’；第Ⅳ類為‘瑞穗’、‘福原早生’、‘白茂木’、‘西農(nóng)枇杷2 號(hào)’、‘津云’。聚類結(jié)果與主成分分析結(jié)果、相關(guān)性分析結(jié)果基本一致。

圖1 14 個(gè)品種枇杷葉7 項(xiàng)指標(biāo)聚類熱圖Fig.1 Clustering heat map of 7 indices of 14 cultivars loquat leaves

3 討論與結(jié)論

枇杷葉作為食品原料及藥材，主要成分含量決定其品質(zhì)優(yōu)劣，進(jìn)而影響到加工食品及成品藥的質(zhì)量。有研究表明，作為主要功能成分的三萜酸及總黃酮，在枇杷葉中含量?jī)H次于枇杷花[36]，因此，枇杷葉有極高的加工利用價(jià)值。影響枇杷葉中主要功能成分含量的因素主要有自身遺傳因子和生態(tài)環(huán)境因子2 大類，本試驗(yàn)材料選取于在相同環(huán)境條件下生長(zhǎng)的葉片，主要研究遺傳因子的影響，比較不同品種間的差異。研究結(jié)果顯示，在不同品種間，主要功能成分含量存在差異；其中黃酮、總酚、三萜酸及FRAP 值4 個(gè)指標(biāo)相互之間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.01），ABTS 陽(yáng)離子自由基清除率和FRAP 值之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.05），這與文獻(xiàn)[33?34]中對(duì)枇杷總黃酮、總酚的體外抗氧化研究結(jié)果一致；與戴云等[35]對(duì)三萜酸與抗氧化研究結(jié)果一致。

現(xiàn)代藥理研究證明，枇杷葉中黃酮類和三萜酸類成分是止咳化痰、抗氧化、抗菌作用的主要成分，直接影響枇杷葉食品及藥材品質(zhì)[37]。植物多酚具有抗氧化、抗衰老、抗癌癥、抗病毒、抗心腦血管疾病等多種功能[38]。對(duì)14 個(gè)品種的試驗(yàn)結(jié)果表明，‘佳伶’、‘麥后黃’和‘培優(yōu)’3 個(gè)品種葉片中總黃酮、總酚和三萜酸含量明顯高于其他多數(shù)品種，綜合排在前三名。這一結(jié)果與霍宇航等[39]針對(duì)6 個(gè)枇杷品種的研究結(jié)果存在偏差，這主要可能是由于在采樣時(shí)間、采樣葉位選取以及檢測(cè)指標(biāo)體系不同引起。

對(duì)14 個(gè)品種枇杷葉的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果表明，綜合排名依次為‘佳伶’、‘麥后黃’、‘培優(yōu)’、‘瑞穗’、‘福原早生’、‘白茂木’、‘西農(nóng)枇杷2 號(hào)’、‘津云’、‘森本’、‘馬克’、‘大五星’、‘ADVANCE’、‘長(zhǎng)崎早生’、‘長(zhǎng)生早生’。其中‘佳伶’、‘麥后黃’和‘培優(yōu)’3 個(gè)品種枇杷葉中總黃酮、總酚和三萜酸含量較高，抗氧化活性較強(qiáng)，品質(zhì)更好，具有更好的藥用價(jià)值和功能性。‘西農(nóng)枇杷2 號(hào)’和‘津云’2 個(gè)品種葉片中多糖、維生素C 含量較高，具有較好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。研究結(jié)果對(duì)于枇杷葉在不同類型產(chǎn)品加工利用時(shí)的品種選取具有一定參考。