茶樹精油對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物被膜的影響

程 峰，劉 宇，楊 珍，莫亞男，尚若鋒，郝寶成，王學紅，梁劍平

（中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，農業農村部獸用藥物創制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州 730050）

由于在人類疾病治療中抗生素的不合理使用，細菌耐藥性問題變得越來越嚴重，特別是耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）的大流行，更是引起了人們對細菌耐藥性問題的廣泛關注[1]。MRSA 可以引起多種疾病，例如醫院獲得性感染、社區獲得性感染、肺炎、敗血癥和皮膚感染[2]。MRSA 還特別容易形成由生物被膜（biofilm，BF），生物被膜是指細菌黏附于接觸表面所形成的大量細菌聚集膜狀物[3]，是細菌為了適應自然環境有利于生存的一種特殊結構。研究表明，生物被膜形成后細菌的數量會顯著增加，并且可以逃避免疫系統的識別[4]。同時，生物被膜可以顯著增加細菌對藥物的抵抗能力，導致細菌耐藥性問題愈發嚴重，有研究表明游離細菌對藥物的敏感性是生物膜態細菌的10～1000 倍左右[5?6]。但是在臨床上只有很少的藥物對MRSA 生物被膜有很好的抑制或者清除作用[7?8]。因此開發一種新的可以有效控制MRSA 生物被膜的藥物迫在眉睫。

茶樹精油（tea tree oil，TTO）是從澳大利亞的桃金娘科互葉白千層的新鮮枝葉中以水蒸汽蒸餾的方式提取出來的一種無色至淡黃色液體，有尖銳的樟腦氣味和薄荷醇的清涼感[9]。茶樹精油具有廣譜抗細菌[10]、真菌[11]、病毒[12]以及寄生蟲[13]等生物活性，因而在香料、農業、食品工業以及化妝品等行業都具有廣泛的應用。研究發現，茶樹精油對金黃色葡萄球菌[10]和白色念珠菌[14]等多種細菌和真菌生物被膜的形成也有一定的抑制作用，可以破壞它們的生物被膜，但其機制尚不完全明確。因此本文選取MRSA的標準菌株ATCC43300 作為實驗菌株，來研究茶樹精油對于MRSA 生物被膜的抑制機制，為茶樹精油作為新型抗菌天然藥物的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MRSA 標準菌株ATCC43300 美國標準菌種庫；茶樹精油 澳大利亞Maincamp 公司；BHI 培養基、TSB 培養基 英國Oxoid（Fisher）公司；MHA/B培養基 北京奧博星公司；RNA 提取試劑盒 杭州博日生物科技公司；q-RT-PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒 日本Takara 公司；LIVE/DEAD? BacLight?試劑盒 美國ThermoFisher Scientific公司。

多功能酶標儀 美國GENE 公司；激光共聚焦顯微鏡 德國ZEISS 公司；超微量紫外分光光度計 美國Plextech 公司；熒光定量PCR 儀 美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶樹精油對MRSA 懸浮細菌的抑制作用 根據CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）藥敏實驗指導標準，使用微量稀釋法測定了茶樹精油對1 株標準菌株（MRSA，ATCC43300）以及12 株臨床分離菌株（金黃色葡萄球菌）的最小抑菌濃度（MIC）以及最小殺菌濃度（MBC）。MIC 指能抑制細菌生長的最小藥物濃度，MBC 指能殺滅99.9%的細菌的最小藥物濃度。

1.2.2 茶樹精油對MRSA 生物被膜形成的抑制作用參照Srdjan 等[15]的方法培養生物被膜并進行染色。首先在TSB 培養中將MRSA 靜置培養24 h 以活化MRSA，然后將活化好的MRSA 用TSB-g（添加了1%葡萄糖的TSB 培養基）培養基稀釋100 倍，同不同濃度的茶樹精油（使茶樹精油的終濃度為0.64%、0.32%、0.16%、0.08%、0.04%和0）一起加到平底的96 孔板中，靜置培養，在6、12、24、36、48 h時棄去培養基，用無菌PBS 清洗3 遍，加入10%的甲醛固定過夜，棄去甲醛晾干，加入0.1%的結晶紫溶液染色30 min 后棄去結晶紫，然后用流水沖洗干凈殘余的結晶紫，至烘箱中烘干，加入95%的乙醇重懸結晶紫，靜置30 min 后在酶標儀上測定OD590。

1.2.3 茶樹精油對成熟生物被膜的清除作用 參照Srdjan 等[15]的方法制備成熟的生物被膜，制備好成熟的生物被膜之后，棄去培養基，用無菌PBS 清洗2～3 次，然后加入用TSB-g 培養基稀釋好的茶樹精油，使茶樹精油的濃度分別為0.16%、0.08%、0.04%、0.02%、0.01%和0。在24 h 時棄去培養基，用無菌PBS 清洗3 遍，加入10%甲醛固定過夜，棄去甲醛，加入結晶紫染色后用流水沖洗干凈，加入95%乙醇重懸結晶紫，靜置30 min 后測定OD590，然后計算不同濃度的茶樹精油對MRSA 生物被膜的清除率，計算公式為清除率（%）=（OD0?OD1）×100/OD0，式中，OD0為茶樹精油濃度為0 時測得的吸光度，OD1為使用不同茶樹精油濃度作用后生物被膜后所測得的吸光度。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察茶樹精油對MRSA 生物被膜的影響 在6 孔板中使用細胞爬片培養生物被膜，并且加入不同濃度的茶樹精油并使茶樹精油的濃度分別為0.16%、0.08%、0.04%和0。使用賽默飛LIVE/DEAD? BacLight?試劑盒進行染色，然后使用蔡司LSM800 激光共聚焦顯微鏡進行拍照，熒光選擇FITC 和Texas Red，用ZEN 2.3 軟件進行圖像處理。

1.2.5 茶樹精油對MRSA 生物被膜形成過程中多糖黏附素（PIA）合成和胞外（eDNA）釋放的影響 參照官妍等[16]的方法，將用TSB 培養基靜置培養活化后的MRSA 接種在含有不同濃度茶樹精油（0.08%、0.04%、0.02%和0）的剛果紅平板上。37 ℃靜置培養24 h 觀察平板變黑的程度，實驗重復3 次。eDNA 的提取參照Kelly 等[17]的方法，將用TSB 培養基活化后的MRSA 用TSB-g 培養基稀釋后加到24 孔板中，然后加入不同濃度的茶樹精油并使茶樹精油的濃度分別為0.16%、0.08%、0.04%、0.02%和0。靜置培養24 h，加入10 μL 的EDTA，置4 ℃冰箱靜置1 h，棄去培養基，加入700 μL 的TEN 緩沖液混勻，測定OD600并記錄，然后將菌懸液移至新的EP 管中，12000 r/min 離心后將上清轉入新的離心管中，用苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）和氯仿/異戊醇（24:1）分別萃取一次，將上層水相加入3 倍體積的100%乙醇與1/10 體積的乙酸鈉中，?20 ℃冰箱過夜后18000×g 離心20 min，棄去上清并加入預冷的70%乙醇洗滌，風干，并溶于20 μL TE 中，用超微量紫外分光光度計測定DNA 濃度。eDNA 的相對表達量用單位生物被膜的eDNA 含量來表示。

1.2.6 茶樹精油對MRSA 生物被膜形成相關基因的影響 MRSA 細菌生物被膜形成有多種相關的基因，采用Primer 5 軟件設計MRSA 生物被膜形成基因cidA，agrA的上下游引物（表1）。將含有0.08%茶樹精油的菌懸液（使用TSB-g 培養基）在6 孔板中靜置培養24 h，使用Simply P Total RNA Extraction Kit （Bioflux）試劑盒提取其總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳驗證提取RNA 的完整性；使用分光光度計測定RNA 的濃度，使用Taraka 反轉錄試劑盒進行反轉錄反應，最后使用Taraka 熒光定量試劑盒進行q-RT-PCR 擴增，試驗重復3 次。

表1 PCR 引物Table 1 PCR primer

PCR 反應體系（20 μL）：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，DNase/RNase-Free Water 6 μL，上、下游引物（10 μmoL/L）各0.8 μL，ROX 0.4 μL，DNA 模板2 μL。PCR 反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃60 s；95 ℃ 15 s。

1.3 數據處理

每組實驗做3 個平行對照，所有實驗數據均以平均值±標準誤差（SE）的形式表示。使用SPSS 23.0 進行t檢驗確定所有數據的統計差異，P<0.05的值被認為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 茶樹精油對懸浮菌的抑制作用

茶樹精油對懸浮菌具有良好的抗菌效果，本研究測定了茶樹精油對MRSA 以及12 株臨床分離得到的金黃色葡萄球菌的MIC 值與MBC 值，如表2所示，茶樹精油對13 株金黃色葡萄球菌的MIC 值在0.08%～0.32%之間，MBC 值在0.16%～0.32%之間。當一個藥物對細菌的MBC/MIC≤4 時被認為是殺菌劑[18]。對于本研究中的大多數菌株來說，茶樹精油對其的MBC 值是MIC 值的2 倍，因此，茶樹精油對本研究中的細菌具有殺菌作用。

表2 茶樹精油對金黃葡萄球菌的MIC 值Table 2 MIC of tea tree oil against Staphylococcus aureus

2.2 茶樹精油對MRSA 生物被膜的影響

如圖1所示，0.64%和0.32%濃度的茶樹精油對MRSA 生物被膜形成的抑制效果最明顯，基本沒有形成生物被膜；0.16%的茶樹精油對MRSA 生物被膜形成的抑制也有顯著效果，在24 和48 h 時的抑制率分別達到65.74%±0.97%（P<0.01）和51.35%±2.13%（P<0.01）；0.04%和0.02%的茶樹精油對MRSA 生物被膜的形成也有一定的抑制效果，24 h 時抑制率分別達到53.44%±0.47%（P<0.01）和41.96%±1.81%（P<0.05）。從圖1中可以看出，茶樹精油對MRSA 生物被膜的形成有較強的抑制效果，并呈現濃度依賴性。

圖1 茶樹精油對MRSA 生物被膜生長的抑制效果Fig.1 Inhibition effect of tea essential oil on MRSA biofilm growth

2.3 茶樹精油對MRSA 成熟生物被膜的清除作用

如圖2所示，茶樹精油對MRSA 成熟的生物被膜具有極顯著的清除作用（P<0.01），與對照組相比，0.02%的茶樹精油即可對MRSA 的生物被膜產生一定的清除作用，隨著濃度的增高，清除率也逐漸增高，當茶樹精油濃度達到0.16%時，清除率達到92.55%±1.15%，接近100%。如圖3所示，激光共聚焦顯微鏡照片也顯示出了茶樹精油對MRSA 成熟生物被膜的強大的清除作用，隨著茶樹精油濃度的升高，活細菌逐漸減少，死細菌逐漸增多，生物被膜逐漸稀疏。通常，去除成熟的生物被膜比抑制其形成更加困難。因此，茶樹精油可以被認為是一種潛在的抗生物被膜劑，因為它不僅可以抑制生物被膜的形成，而且可以破壞成熟的生物被膜。所以有必要進一步研究茶樹精油的抗生物被膜活性并闡明其作用機理。

圖2 茶樹精油對MRSA 成熟生物被膜的清除作用Fig.2 Clearance of tea tree oil against MRSA mature biofilm

圖3 激光共聚焦顯微鏡細下MRSA 生物被膜圖像Fig.3 CLSM image of LIVE/DEAD stained MRSA biofilms grown on cell slide

2.4 茶樹精油對MRSA 生物被膜影響的初步機制探究

PIA 對于生物被膜形成的黏附階段和聚集階段具有重要的意義[19]。PIA 與剛果紅特異性反應變黑，根據平板變黑的程度可以判斷PIA 產生量的多少。由圖4可知，隨著藥物濃度的增加，黑色逐漸變淺，表明PIA 的合成量逐漸減少，說明茶樹精油可以抑制MRSA 生物被膜中PIA 的合成。

圖4 茶樹精油對MRSA 生物被膜中PIA 的影響Fig.4 Effect of tea tree oil on PIA in MRSA biofilm

eDNA 是細菌在形成生物被膜過程中部分細菌裂解釋放的生物被膜基質（EPS）重要組成成分[20]，在生物膜形成的各個階段都起著至關重要的作用，包括初始細菌粘附、聚集、微菌落形成以及生物膜結構的確認[21]。如圖5所示，茶樹精油即可對MRSA 生物被膜形成過程eDNA 的釋放有一定的抑制效果，在茶樹精油濃度為0.16%時，eDNA 的含量減少了91.25%±2.46%（P<0.01）。并且抑制效果呈現濃度依賴性，隨著茶樹精油濃度的增加，抑制效果也變得更加明顯。eDNA 以及PIA 含量的降低說明細菌之間的黏附能力下降，導致其生物被膜的完整性被破壞，表現出抗生物被膜活性。因此，茶樹精油可能通過eDNA 的釋放以及PIA 的合成抑制MRSA 生物被膜的形成。

圖5 茶樹精油對eDNA 分泌的影響Fig.5 Influence of tea tree oil effect on the secretion of eDNA

生物被膜形成過程中關鍵的調控基因有agr、ica、cid、sar等。agr主要調控細菌的群體感應系統，有研究證明agr是細菌群體感應系統（QS）的主要調控分子，對生物被膜的成熟階段至關重要[22]。ica基因主要調控PIA 的合成，同時也可以調節細菌之間的黏附和聚集[23]。cid主要調控細菌的程序性死亡與溶解，可以間接地參與調控eDNA 的釋放[24]。sarA是金黃色葡萄球菌的全局調控因子，主要調控金黃色葡萄球菌毒力基因的表達調控系統；sarA可以和ica操縱子的啟動子結合促進ica的表達，進而影響PIA 的合成[25]。采用熒光定量PCR 對茶樹精油對MRSA 生物被膜形成過程中這些基因的表達的影響進行研究，使用2?ΔΔt對基因的表達進行相對定量，熒光定量PCR 結果如表3所示。茶樹精油作用后的MRSA 細胞內agrA、cidA、sarA、icaA等基因的表達水平均下調，茶樹精油對以上4 種基因的表達均有顯著的抑制作用，因此，茶樹精油可能通過抑制agrA、icaA、cidA 及sarA等基因的表達從而抑制的MRSA 生物被膜中eDNA 的釋放以及PIA 的合成，進一步表現出抗MRSA 生物被膜活性。

表3 茶樹精油作用后MRSA 部分基因表達量的變化Table 3 Changes in the expression of some genes in MRSA treatment by tea tree essential oil

3 結論

綜上所述，茶樹精油可以有效殺滅MRSA 的懸浮菌，并具有強大的抗生物被膜作用，結晶紫半定量和激光共聚焦實驗說明茶樹精油不僅可以抑制生物被膜的形成，也可以有效地清除成熟的生物被膜。其可能的機理是茶樹精油通過抑制agrA、icaA、cidA及sarA4 種基因的表達，從而抑制MRSA 細菌生物被膜形成過程中eDNA 的釋放以及PIA 的合成，由此降低生物被膜的粘附性，表現出抗生物被膜活性。同時，茶樹精油本身也是一種良好的殺菌劑，對脫離了生物被膜的MRSA 細菌也具有強大的殺滅作用。而關于茶樹精油如何抑制生物被膜形成相關基因的表達仍需要進一步的深入研究。