一株酸面團源乳酸菌的益生特性及其對刺五加葉總皂苷的影響

國立東，李秀萍，張 煥，陳 晨，王麗群

（1.黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江省農業科學院食品加工研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

傳統發酵食品，如酸奶、發酵香腸、酸面團等，蘊含著豐富的乳酸菌資源，乳酸菌經口攝入可順利通過胃酸和膽汁脅迫，并以相當數量活菌進入腸道[1]從而發揮其益生功能，包括降膽固醇[2]、抗糖尿病[3]、抗肥胖[4]、抗抑郁[5]等。微生物因生長速度快、酶系豐富，可高效轉化中草藥活性成分從而提高藥效[6]，近年來作為一般公認為安全（generally recognized as safe,GRAS）的乳酸菌，因安全性高且為益生菌的重要來源而備受關注，其在人參[7]等單味中藥，小柴胡湯[8]、四君子湯[9]等中藥經典名方的生物轉化方面展現出了積極作用。值得注意的是，這些都因菌種及菌株而異。因此，獲得具有益生功能且可高效轉化藥食同源中藥有效成分的乳酸菌菌株，進而開發兼具活性益生乳酸菌與高水平藥食同源活性物質于一體的保健食品具有重要意義。

刺五加是黑龍江省道地藥材，根及根莖均可入藥，具有益氣健脾、補腎安神之功效。關于刺五加的乳酸菌發酵轉化鮮有報道，研究人員發現乳酸菌發酵刺五加可提高其異嗪皮啶含量，降低紫丁香苷水平[10]。然而，刺五加藥用根及根莖的過度使用，使其被列為漸危植物，屬于國家三級保護野生藥材物種，禁止采挖幼株，但刺五加葉為可再生資源，可大量使用，已作為山野菜或加工成茶開發利用，成為當地一種特色農產品[11]。值得關注的是刺五加葉與根部具有類似的化學成分及生物活性，其中皂苷為其主要活性物質之一[12]，故深入挖掘刺五加葉的開發利用途徑具有重要意義。以刺五加葉為發酵基質進行乳酸菌發酵尚無相關報道，乳酸菌能否通過生物轉化提高刺五加葉皂苷水平仍有待于證實。

鑒于以上考慮，本研究以前期分離的一株可形成溶鈣圈的酸面團源分離菌株HUCM105 為出發菌株，通過形態學及分子生物學手段對其進行種屬鑒定，并進一步評價其益生特性，包括酸和膽汁的耐受性及體外去除膽固醇的能力，同時考察其對刺五加葉水提液為唯一基質的發酵能力，以及發酵后刺五加葉總皂苷含量的變化，旨在為益生菌生物轉化刺五加葉總皂苷及二者聯合使用開發活性益生菌發酵的保健產品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺五加葉 采自黑龍江省伊春市豐林縣野生刺五加植株嫩葉；菌株HUCM105 分離自黑龍江地區家庭長期使用的傳統自然發酵酸面團；膽固醇 美國Amresco 公司；牛膽粉 德國Merck 公司；齊墩果酸對照品 成都曼思特生物科技有限公司；香草醛

天津市光復精細化工研究所；硝酸鋁 天津市巴斯夫化工有限公司；細菌基因組提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑 均為國產分析純。

SW-CJ-2D 超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DM2500 顯微鏡 上海徠卡顯微鏡有限公司；SPX-200-II 生化培養箱 上海躍進醫療器械廠；BSD-100 振蕩培養箱 上海博訊實業有限公司；BXM-30R 全自動高壓滅菌鍋 上海博訊實業有限公司；TGL-16 離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；SP-752（PC）紫外-可見分光光度儀 上海光譜儀器有限公司；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器

昆山市超聲儀器有限公司；XL-16B 800 密封搖擺式粉碎機 廣州市旭朗機械設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的鑒定 菌株HUCM105 采用改良MRS（mMRS）固體培養基[13]于37 ℃培養24 h，記錄形成菌落的特征，同時進行過氧化氫酶試驗，挑取單菌落進行革蘭氏染色觀察，并記錄菌體細胞特征。隨后，參照文獻[13]的方法進行16S rDNA 基因的擴增及測序，并利用MEGA5.1 軟件與乳桿菌屬內模式菌株的16S rDNA 基因序列進行比對分析，通過構建系統發育樹確定其種屬。

1.2.2 酸耐受性測定 菌株HUCM105 對酸的耐受性是通過其在酸性條件下的存活情況來評價。菌株HUCM105 經mMRS 液體培養基連續傳代3 次以活化，離心收集菌泥，并分別用pH 2.0、pH 2.5 或pH 3.0 的mMRS 液體培養基重懸，37 ℃培養3 h，分別于0、1、2、3 h 取樣采用平板菌落計數法測定活菌數，從而確定其對酸的耐受能力。

1.2.3 膽汁耐受性測定 菌株HUCM105 對膽汁的耐受性是通過其在膽汁環境中的存活情況來評價。傳代3 次活化的菌株HUCM105 發酵液經離心收集菌泥，用含0.5%牛膽汁的mMRS 液體培養基重懸，37 ℃培養3 h，采用平板菌落計數法分別檢測0、1、2、3 h 的活菌數，從而確定其對膽汁的耐受能力。

1.2.4 膽固醇去除能力的測定 菌株HUCM105 體外對膽固醇的去除能力，主要是通過其與富含膽固醇培養基共培養前后培養液中膽固醇含量的變化進行評價。簡言之，活化的菌株HUCM105 按1%接種至含0.3%牛膽汁和100 μg/mL 膽固醇的mMRS 液體培養基，37 ℃培養24 h，離心得上清液，并測定膽固醇含量，膽固醇含量測定采用鄰苯二甲醛法[14]，膽固醇去除率參照文獻[15]方法計算。

1.2.5 刺五加葉水提液的制備 刺五加葉陰干并粉碎得刺五加葉干粉。精密稱取10.00 g 刺五加葉干粉，用100 mL 蒸餾水重懸于250 mL 錐形瓶中，室溫下超聲波（500 W，40 kHz）處理1 h，并經121 ℃滅菌15 min 得刺五加葉水提液，冷卻至室溫備用。

1.2.6 刺五加葉水提液的發酵 菌株HUCM105 在mMRS 液體培養基中連續傳代（37 ℃，24 h）2 次后，發酵液經離心得菌泥，用等體積PBS 緩沖液（pH7.2）洗滌2 次，得PBS 重懸菌液，并按1%接種至刺五加葉水提液中，分別于37 ℃靜置或振蕩（80 r/min）培養3 d。

1.2.7 刺五加葉發酵液活菌數的測定 分別于發酵第0、24、48、72 h 取菌株HUCM105 發酵刺五加葉水提液的發酵液，采用平板菌落計數法測定不同時間點的活菌數。發酵液經適當梯度稀釋后涂布于mMRS 固體培養基，37 ℃培養24 h 后進行菌落計數。

1.2.8 刺五加葉發酵液總皂苷含量的測定 菌株HUCM105 發酵刺五加葉水提液期間，分別于發酵第0、24、48、72 h 取發酵液，先后經離心及0.45 μm濾膜過濾得濾液，并對濾液中總皂苷含量進行檢測。

總皂苷含量的測定參考文獻[16]方法，取1 mL濾液水浴揮干，依次加0.5 mL 8%香草醛無水乙醇溶液和5 mL 72%硫酸，振蕩混勻并于60 ℃水浴10 min，冷卻至室溫測定吸光值A542nm，以齊墩果酸為對照品繪制標準曲線，標準曲線方程為y=0.0063x+0.008，R2=0.9992。

1.3 數據處理

試驗數據采用SPSS 17.0 軟件應用單因素方差分析進行組間比較，每個試驗做三個重復，P<0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 菌株HUCM105 的鑒定

2.1.1 形態學特征 將菌株HUCM105 接種至mMRS 固體培養基中，于37 ℃培養24 h，形成的單菌落如圖1（A）。單菌落為圓形，邊緣完整，低凸，表面光滑，乳白色，不透明，質地黏稠。在菌落表面滴加3%過氧化氫無氣泡產生，為過氧化氫酶陰性菌株。挑取單菌落進行革蘭氏染色觀察，如圖1（B），菌株HUCM105 為革蘭氏陽性，菌體細胞為短桿，單在或成對排列。這些均符合乳酸菌的基本特征。

圖1 菌株HUCM105 的形態學特征Fig.1 The morphology characteristics of the strain HUCM105

2.1.2 16 S rDNA 序列比對分析 菌株HUCM105的16S rDNA 基因經測序，獲得1488 bp 長度的序列，經BLAST 后發現與乳桿菌屬的同源性最高。從GenBank 數據庫中獲取11 株代表性的乳桿菌屬內模式菌株的16S rDNA 基因序列，以非同屬的Escherchia coli模式菌株為外標，利用MEGA5.1 軟件經兩端對齊后進行序列比對分析，并繪制系統發育樹，結果如圖2所示。

由圖2可知，菌株HUCM105 同Lactobacillus brevisATCC 14869 模式株的親緣關系最近，序列相似度大于99%，故將HUCM105 菌株鑒定為短乳桿菌（L.brevis）。

圖2 基于16S rDNA 基因序列構建的系統發育樹Fig.2 The phylogenetic tree based on the 16S rDNA gene sequences

2.2 菌株HUCM105 的酸耐受能力

三種酸性條件pH2.0、pH2.5 和pH3.0 下，短乳桿菌HUCM105 在37 ℃培養不同時間其活菌數的變化情況如圖3所示。菌株HUCM105 在pH2.5和pH3.0 酸性條件下維持3 h，其活菌數均無顯著變化（P>0.05），一直維持在109CFU/mL 水平，而pH2.0酸性條件對菌株HUCM105 的存活影響較大，處理1 h 后存活率降為21.1%，2 h 后活菌數僅能維持在103CFU/mL 水平，而培養3 h 后則無活菌檢出。短乳桿菌HUCM105 的酸耐受能力明顯優于先前報道的植物乳桿菌HUCM115，后者在pH 2.0 條件下處理1 h 后存活率僅為4.4%，2 h 后則無活菌檢出[15]。

圖3 不同酸性條件下短乳桿菌HUCM105 的存活情況Fig.3 The viability of Lactobacillus brevis HUCM105 under different acidic conditions

2.3 菌株HUCM105 的膽汁耐受能力

短乳桿菌HUCM105 在0.5%濃度的膽汁環境中培養3 h，每隔1 h 培養液中活菌數變化結果如圖4所示。整個培養期間，0.5%膽汁處理1 h 時活菌數（1.4×109CFU/mL）最高，與0 h（9.4×108CFU/mL）差異不顯著（P>0.05），但與2 h 或3 h 相比差異顯著（P<0.05）。0.5%膽汁處理2 h 與3 h 相比，活菌數無顯著差異（P>0.05）。菌株HUCM105 經0.5%膽汁處理后活菌數先出現微弱增加后降低的趨勢，說明培養初期膽汁可能對其生長具有一定的促進作用。0.5%膽汁環境培養3 h 后，菌株HUCM105 存活率為78.1%，自2 h 以后活菌數趨于穩定，一直維持在5.0×108CFU/mL 水平以上，與初始菌數無明顯差異（P>0.05），說明0.5%膽汁脅迫處理3 h 不會對菌株HUCM105 的活力產生影響，短乳桿菌HUCM105對膽汁表現出了良好的耐受能力，與前期報道的植物乳桿菌HUCM115 的膽汁耐受能力相當[15]。

圖4 0.5%膽汁對短乳桿菌HUCM105 存活力的影響Fig.4 Effect of 0.5% oxgall on the viability of Lactobacillus brevis HUCM105

2.4 菌株HUCM105 的膽固醇去除能力

短乳桿菌HUCM105 在含膽固醇培養基中37 ℃培養24 h，培養前后培養上清液中膽固醇含量測定結果如表1所示。短乳桿菌HUCM105 在富含膽固醇的環境中37 ℃發酵24 h，可去除其中26.4%膽固醇，說明該菌株具有一定的體外降膽固醇特性，且膽固醇去除率較實驗室前期報道的植物乳桿菌HUCM115 高28.2%[15]。

表1 短乳桿菌HUCM105 的膽固醇去除能力Table 1 Cholesterol removal ability of Lactobacillus brevis HUCM105

2.5 菌株HUCM105 發酵刺五加葉的特性

菌株HUCM105 以刺五加葉水提液為唯一基質進行發酵，考察刺五加葉發酵期間菌株HUCM105活菌數的變化及其對刺五加葉總皂苷含量的影響，以此評價其對刺五加葉的發酵和轉化總皂苷的能力，結果如圖5所示。

圖5 菌株HUCM105 發酵刺五加葉的特性Fig.5 The properties of Acanthopanax senticosus leaves fermented by the HUCM105 strain

菌株HUCM105 在刺五加葉水提液中靜置或振蕩培養24 h 時，活菌數均達到最高，靜置培養24 h活菌數從初始菌數3.9×107CFU/mL 上升至5.9×108CFU/mL，隨后菌數逐漸降低，至72 h 時降為1.9×108CFU/mL；振蕩培養24 h 活菌數從初始菌數4.4×107CFU/mL 上升至4.7×108CFU/mL，隨后菌數逐漸降低，至72 h 時降為1.5×108CFU/mL。菌株HUCM105 在刺五加葉水提液中靜置或振蕩培養條件下，其生物量變化趨勢及關鍵節點基本相同，雖然在初始菌數上靜置培養稍低于振蕩培養，但從不同培養時間點的活菌數水平看，靜置培養均略高于振蕩培養，這說明菌株HUCM105 的生長更適于低氧環境。

菌株HUCM105 在刺五加葉水提液中靜置培養72 h，不同時間點發酵液中總皂苷含量變化不大，差異不顯著（P>0.05）。相比之下，振蕩培養條件下隨著培養時間的延長發酵液中總皂苷含量變化呈先上升后下降的趨勢，發酵液中總皂苷含量最高的時間點并不是出現在活菌數最高的24 h，而是出現在培養48 h，其總皂苷含量達42.6 μg/mL，較初始總皂苷含量提高了79.0%（P<0.05），總皂苷水平最高的時間點滯后于活菌數最高的時間點，這說明菌株HUCM105代謝產生的皂苷轉化酶可能具有胞內酶活性，當其處于衰亡期時會釋放出更多的胞內皂苷轉化酶，從而轉化生成更多的皂苷。此外，振蕩培養活菌數略低于靜置培養，但總皂苷含量卻高于靜置培養，這可能與振蕩培養時乳酸菌細胞與刺五加葉水提液之間接觸更為充分從而使酶與底物之間反應更為徹底有關。由此說明，不同培養方式及培養時間對菌株HUCM105發酵刺五加葉總皂苷含量影響較大，菌株HUCM105與刺五加葉水提液經振蕩培養可顯著提高刺五加葉總皂苷含量，在生物轉化刺五加葉總皂苷方面具有潛在的應用價值。

3 討論

供試酸面團源菌株HUCM105 經形態學特征及16S rDNA 序列分析鑒定為短乳桿菌，短乳桿菌是傳統發酵酸面團中常見的優勢菌種之一[17]，不僅對酸面團的質構及風味起積極作用[18]，而且具有潛在的益生功能[19?20]。益生菌若能在體內發揮作用，則需要以相當活菌數量進入人體腸道。消化道脅迫環境被認為是益生菌順利進入腸道的一道屏障，故酸和膽汁通常被用于體外評價益生菌對消化道的抵抗能力[21]。短乳桿菌HUCM105 在pH2.5 以上的酸性環境孵育3 h，其活菌數無明顯變化，展現出了良好的酸耐受性，其對酸的耐受能力明顯優于Mancini 等[22]報道的兩株短乳桿菌，pH2.5 條件下處理3 h 后，短乳桿菌DSM 32386 的活菌數下降了兩個數量級，而短乳桿菌DSM 20054 則無活菌檢出。短乳桿菌對膽汁的耐受能力因菌株而異，Vasiee 等[23]從意大利傳統發酵食品中分離的4 株短乳桿菌中，只有3 株能在0.5%膽酸鹽環境中生長，而奶酪源短乳桿菌DSM 32386 經0.3%膽汁處理3 h 后活菌數從105下降到102水平[22]，相比之下，短乳桿菌HUCM105在0.5%膽汁環境中培養3 h，活菌數無顯著變化，表現出良好的耐受性。由此推測，短乳桿菌HUCM105可抵抗消化道脅迫作用，并以相當活菌數量順利進入腸道進而發揮其益生作用。

近年來，已有大量臨床研究顯示乳酸菌在降低人體血清膽固醇水平上具有積極作用[24]，體外試驗因周期短且操作簡便而通常作為篩選體內具有降膽固醇作用乳酸菌的先決條件。短乳桿菌HUCM105 在富含膽固醇培養基中生長24 h 可去除四分之一以上的膽固醇，可作為潛在候選降膽固醇菌株，其降膽固醇能力略低于姜華等[25]報道的短乳桿菌JH-1，而Watanabe 等[19]報道的8 株短乳桿菌中，只有3 株膽固醇去除率超過20%，這也說明了短乳桿菌的降膽固醇特性存在菌株特異性。

中藥的微生物轉化作用，體現了中藥現代化[26]。乳酸菌之所以被選擇用于轉化中藥，與其高安全性有直接關系，其在單味藥及經典方劑的生物轉化方面取得了一定進展[7?8,27?28]。然而，關于乳酸菌生物轉化刺五加的研究鮮有報道，而開發具有類似化學成分且可再生的刺五加葉，對保護中藥刺五加資源尤為重要，故以刺五加葉為研究對象，選取了植物基來源的菌株HUCM105，試圖探尋其發酵刺五加葉的可能性并考察其對刺五加葉總皂苷含量的影響，以期為開發兼具活性乳酸菌與刺五加葉皂苷的發酵產品提供理論支持，結果表明供試菌株HUCM105 可以刺五加葉水提液為唯一發酵基質，維持較高水平的活菌數量，且振蕩培養可提高刺五加葉總皂苷水平。刺五加葉皂苷具有降血脂作用[29]，故短乳桿菌HUCM105發酵刺五加葉產品在降血脂方面可體現雙重疊加效果，不僅可通過短乳桿菌HUCM105 自身的降膽固醇作用，也可通過其發酵促進刺五加葉總皂苷生成途徑提高降血脂功效，具有廣闊的開發前景。短乳桿菌HUCM105 促生皂苷的機制源于何種關鍵酶作用[30]尚有待于進一步研究。此外，已有研究表明短乳桿菌具有一定的糖苷酶活性，可使人參皂苷原型去糖基化轉化為稀有皂苷CK[7]，后者為小分子皂苷，腸道內更易吸收而發揮藥效[31]，短乳桿菌HUCM105能否將刺五加葉皂苷原型轉化為更易吸收的小分子皂苷仍需進一步深入研究加以確定。

總之，酸面團源短乳桿菌HUCM105 可耐受酸和膽汁脅迫，并具有降膽固醇作用，同時可以刺五加葉水提液為唯一發酵基質，維持較高活菌數量并可提高刺五加葉總皂苷水平，可作為候選益生菌株用于發酵刺五加葉提高其功效，進而為益生菌發酵刺五加葉產品的開發提供理論支持。