海洋細菌BMF04菌株的抑菌和毒素去除作用

彭 云，李文進，湯曼利，周榮翔，李霽虹，董 霆，王雨婷，馬桂珍，暴增海

（江蘇海洋大學海洋生命與水產學院，江蘇連云港 222005）

小麥赤霉病（FusariumHead Blight,FHB）是由小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）和小麥雪腐鐮刀菌（Fusarium nivale（Fr）Ces.）等多種鐮刀菌引起的真菌病害[1]，感病后導致籽粒皺縮，品質下降，產生可破壞人和動物的免疫系統、致癌、致畸的等多種毒素，嚴重威脅到人畜的健康安全[2?4]。ZEN 毒素是世界上污染最為廣泛的鐮刀菌毒素，在全世界谷物以及農副產品中檢出率高90%[5]，我國糧食原料及飼料中霉菌毒素污染十分普遍且嚴重[6?8]，不同地區和不同季節的原料及飼料產品檢出率為70%～100%[9]。開發安全有效的方法控制毒素的產生和去除已產生的毒素迫在眉睫。

傳統的毒素降解方法主要有物理降解法和化學降解法。工業上主要采取活性炭、硅鋁酸鹽、寡聚糖等物理吸附劑吸附，其有較強選擇性，能有效降低生產成本，但是物理吸附劑易破壞營養成分而影響營養素的吸收。Volko 等[10]研究表明，毒素吸附劑不能有效徹底去除ZEN 毒素，對動物的生產性能產生很大影響。化學脫毒法通過氧化處理或堿處理，可達到比物理脫毒方法更好的效果，但化學脫毒方法難以在實際生產中大規模進行，添加化學試劑可能在糧食和飼料中有殘留，造成營養物質破壞和二次污染等，存在著不可避免的局限性[11]。生物降解法主要由微生物產生的次級代謝產物和胞內、胞外酶分解毒素，產生的降解產物無毒，并對原料中的其他成分沒有破壞作用，不會降低營養價值，是解決霉菌毒素污染的發展方向和趨勢。目前用于毒素降解的微生物菌株較少，篩選既能夠高效抑制小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌生長又能去除毒素的微生物生防菌株，可以有效減少小麥赤霉病的發生和毒素的產生，對于保障食品安全有重要意義[12?14]。國內外不同學者已經從土壤等不同環境中分離到一些降解ZEN 毒素的微生物菌株，主要有紅球菌（Rhodococcus）[15?16]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[17?18]、鏈霉菌（Streptomyces）[19]、假單胞菌（Pseudomonas）[20]、酵母菌等[21?22]，應用微生物去除毒素已經成為發展趨勢。

BMF04 菌株是本實驗室從連云港海域分離的對多種病原菌具有較強抑制作用，并具有促生作用的甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）[23]，有關該菌株對小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀病菌的抑制作用及其對ZEN 毒素的去除作用尚未進行研究，本研究測定該菌株對小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀病菌菌絲的抑菌作用和對ZEN 毒素的降解作用，探究其降解ZEN 毒素的降解機理，為該菌株用于降解ZEN 毒素提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株：海洋甲基營養型芽孢桿菌BMF04（B.methylotrophicus） 由本實驗室從連云港海域分離并保存；小麥赤霉病菌（F.graminearum）、小麥雪腐鐮刀菌（F.nivale（Fr）Ces.）、大腸桿菌（Escherichia coli）、解淀粉芽孢桿菌GM-1-2（Bacillus amyloliquefaciens） 由本實驗室分離并保存；PDA 培養基、PD 培養基、DF 培養基（2.44 g/L Na2HPO4，1.52 g/L KH2PO4，0.5 g/L（NH4）2SO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，0.05 g/L CaCl2） 實驗室自配；玉米赤霉烯酮毒素（ZEN） 江蘇省農業科學院糧食作物研究所制備提供；胰蛋白酶（25 萬 U/g） Biosharp 公司；胃蛋白酶（300 萬～350 萬 U/g） Bio Basic Inc 公司；蛋白酶K（4 萬 U/g） 德國MERCK 公司。

安捷倫1260 高效液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器、OpenLAB 3.3.2 SP3 安捷倫液相色譜化學工作站） 美國安捷倫公司；Biosafer-20TC 實驗室級超純水器 賽飛（中國）有限公司；MIKIO 200 R 高速冷凍離心機 德國Hettich 科學儀器有限公司；JY92-IIDN 超聲波細胞粉碎機隔音箱 上海凈信實業發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 BMF04 菌株及無菌發酵液對小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲生長的抑制作用

1.2.1.1 菌株對小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲生長的抑制作用 采用平板對峙法測定BMF04菌株對小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲的抑制作用。小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌在PDA 平板上28 ℃培養3 d，用打孔器取直徑1 cm 的菌苔分別接種于新的PDA 平板中央，在距離培養皿邊緣2 cm 處劃線接種BMF04 菌株，接種3 次為3 重復，以不接菌為對照，28 ℃培養3 d，測定抑菌帶寬度。

抑菌帶寬度（mm）=對照病原菌菌落半徑（mm）?處理病原菌菌落半徑（mm）[24]

1.2.1.2 無菌發酵液對小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲生長的抑制作用 將BMF04 菌株接種到裝有60 mL PD 培養基的250 mL 三角瓶中，28 ℃，180 r/min 振蕩培養52 h。發酵液于4 ℃、8000 r/min離心15 min，將上清液用0.22 μm 的微孔過濾器過濾得到無菌發酵液。采用打孔法測定無菌發酵液對小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲的抑制作用。在PDA 平板中央接種直徑5 mm 的培養了3 d 的小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌苔，在距病原菌15 mm 處等距離用直徑8 mm 的打孔器打孔，每孔分別加入150 μL 不同菌株的無菌發酵液，以等量PD 培養基為對照，28 ℃恒溫培養3 d，測量BMF04菌株無菌發酵液對小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌的抑菌圈直徑，每個病原菌株3 次重復[24]。

1.2.2 BMF04 菌株對ZEN 毒素去除作用的研究

1.2.2.1 定性測定 挑取BMF04 菌株接種在濃度為4 μg/mL 含ZEN 毒素平板上，28 ℃培養3 d，觀察BMF04 菌株的生長情況，若BMF04 菌株能生長，說明該菌株具有去除ZEN 毒素作用。以不具有毒素去除作用的大腸桿菌（E.coli）為陰性對照，以具有解毒作用的B.amyloliquefaciens的GM-1-2 菌株為陽性對照[25]。

1.2.2.2 定量測定 ZEN 毒素標準曲線的制作：分別配制2、4、6、8、10、12、14、16 μg/mL ZEN 毒素溶液，采用HPLC 法測定不同濃度毒素溶液的色譜峰面積，每個濃度測定3 次取平均值。HPLC 檢測ZEN 毒素的條件：色譜儀為安捷倫高效液相色譜儀；色譜柱為安捷倫反相C18柱，孔徑4 μm，長250 mm×寬4.6 mm；流動相為甲醇:水=80:20（V/V）；紫外檢測波長為236 nm；柱溫25 ℃；進樣量20 μL；流速1 mL/min。以ZEN 濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制ZEN 標準曲線。

BMF04 菌株對ZEN 毒素的去除作用測定：挑取BMF04 菌株接種于PDA 培養基斜面，28 ℃培養18 h，用無菌DF 培養基洗下菌體，并調節其菌懸液濃度為107CFU/mL，菌懸液中加入濃度為1 mg/mL的ZEN 毒素母液，使毒素的終濃度為4 μg/mL，28 ℃、180 r/min 振蕩培養48 h，4 ℃、12000 r/min 條件下離心15 min，上清液用孔徑為0.45 μm 細菌過濾器過濾，利用HPLC 檢測上清液中的峰面積，3 次重復，以不加菌懸液的含等量毒素的DF 培養基為對照（CK），將峰面積代入所建立的ZEN 毒素標準曲線，計算溶液中毒素濃度和去除率，如去除率達到100%，再增加菌懸液中毒素含量[26]。

去除率（%）=（CK 毒素濃度?樣品中毒素濃度）/CK 毒素濃度×100

1.2.3 BMF04 菌株去除ZEN 毒素的作用機理研究

1.2.3.1 BMF04 菌株去除ZEN 毒素方式研究 將活化18 h 的BMF04 菌株斜面用5 mL PD 洗下制成菌懸液，倒入裝有55 mL 種子液培養基的250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min 振蕩培養24 h，發酵液于4 ℃、8000 r/min 離心15 min，分別收集發酵上清液和菌體沉淀。上清液過濾除菌得到無菌發酵液；將菌體沉淀用DF 培養基洗滌3 次，用等體積DF 培養基重懸菌體得到活菌懸浮液，菌體密度為107CFU/mL。無菌發酵液和活菌懸浮液121 ℃滅菌30 min，得到滅活無菌發酵液和滅活菌懸浮液；活菌懸浮液用超聲細胞破碎儀處理，至菌體充分破碎，冰浴功率比20%，工作時間為3 s，間隙時間5 s，循環工作至活菌懸浮液呈透明狀，4 ℃，8000 r/min，離心15 min，分別收集上清液和沉淀，上清液用0.45 μm 濾膜過濾，濾液為胞內液；沉淀為細胞壁組分，用等量DF 培養基重懸，得到細胞壁懸浮液。取BMF04 菌株活菌懸浮液、滅活菌懸浮液、無菌發酵液、滅活無菌發酵液、胞內液和細胞壁懸浮液，分別加入ZEN 毒素母液，使ZEN 毒素終濃度為15 μg/mL，28 ℃、180 r/min振蕩培養48 h，測定不同處理的峰面積，計算不同樣品中ZEN 毒素濃度和去除率[27]。

1.2.3.2 蛋白酶對BMF04 菌株去除ZEN 毒素作用的影響 BMF04 菌株的無菌發酵液中，分別加入胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K，使酶的終濃度為1 mg/mL，用2 mol/L 的HCl 和NaOH 溶液調節胰蛋白酶反應體系pH 為7.6、胃蛋白酶為pH2.0、蛋白酶K 為pH8.7，37 ℃水浴2 h，調回初始pH。取不同蛋白酶酶解后的樣品，加入ZEN 毒素母液，ZEN 毒素終濃度為4 μg/mL，28 ℃靜置12 h，采用HPLC的方法檢測樣品中ZEN 毒素峰面積，計算不同蛋白酶處理的無菌發酵液對ZEN 毒素的降解率。以未加蛋白酶的無菌發酵液為對照（CK1），未加無菌發酵液為空白對照（CK2），每種蛋白酶為1 處理，每個處理3 次重復[28?29]。

1.3 數據處理

實驗中每個處理重復三次，使用SPSS 22.0 軟件對實驗數據進行統計分析，差異顯著性采用Duncan檢驗進行多重比較（P<0.05），利用Microsoft Excel進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 BMF04 菌株及無菌發酵液對小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲生長的抑制作用

BMF04 菌株和無菌發酵液對小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲生長具有明顯的抑制作用（圖1）。BMF04 菌株對兩種病原菌的抑菌帶寬度分別為（25.73±1.42）mm 和（26.80±1.31）mm，無菌發酵液對兩種病原菌的抑菌圈直徑分別為（14.67±2.52）mm和（15.00±1.00）mm，表明該菌株與無菌發酵液對小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌都具有較強的抑制作用。

圖1 BMF04 菌株及無菌發酵液對小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌菌絲的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of strain BMF04 and its aseptic fermentation broth on F.graminearum and F.nivale (Fr) Ces

2.2 BMF04 菌株對ZEN 毒素去除作用的定性測定

BMF04 菌株和陽性對照GM-1-2 菌株在含ZEN毒素平板上生長良好（圖2），陰性對照大腸桿菌（E.coli）不生長，說明BMF04 菌株能夠在以ZEN 毒素為唯一碳源的DF 培養基上生長，具有去除ZEN 毒素的作用。

圖2 不同菌株在含ZEN 毒素平板上的生長狀態Fig.2 The growth state of different strains on ZEN plate

2.3 BMF04 菌株對ZEN 毒素降解的定量測定

2.3.1 ZEN 毒素標準品的檢測 由圖3可知，ZEN標準品的出峰時間約為2.689 min，峰型清晰無拖尾，與其他的峰沒有重合，能夠清晰地測量出相應的峰面積。表明該檢測方法可用于ZEN 毒素的檢測。

圖3 ZEN 標準品HPLC 檢測圖譜Fig.3 HPLC analysis map of ZEN standard substance

2.3.2 ZEN 毒素標準曲線的建立 配制不同梯度濃度的ZEN 毒素溶液，利用HPLC 測定其毒素的峰面積，以ZEN 毒素濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制ZEN 標準曲線（圖4）。結果表明，在0～16 μg/mL濃度范圍內，峰面積隨著ZEN 毒素濃度的增加而逐漸增大，呈正相關，標準曲線方程為y=82.727x+1.2333，R2為0.9996，線性相關性較好。

圖4 ZEN 毒素的標準曲線Fig.4 The standard curve of ZEN

2.3.3 BMF04 菌株對ZEN 毒素去除率的測定 HPLC檢測ZEN 毒素初始濃度為4、10 和15 μg/mL 的對照峰面積分別為（323.28±5.69）、（818.29±4.74）和（1234.68±24.83），加標回收率分別為97.25%±1.75%、98.80%±0.60%和99.40%±2.00%，與加入的ZEN 標準品初始濃度擬合程度較高，說明儀器靈敏度好，檢測結果準確。將BMF04 菌株接種到ZEN 毒素終濃度為4 和10 μg/mL 的DF 培養液中，28 ℃培養48 h，HPLC 檢測ZEN 毒素未出現吸收峰，說明該濃度下BMF04 菌株能完全降解ZEN 毒素，去除率為100%；當增加ZEN 毒素濃度為15 μg/mL，檢測到ZEN 毒素峰面積為（12.96±0.14），ZEN 毒素濃度為（0.14±0.01）μg/mL，去除率仍為98.95%±1.27%（表1）。說明BMF04 菌株對ZEN 毒素具有較強的去除能力。

表1 BMF04 菌株對不同濃度ZEN 毒素的去除率Table 1 Removal rate of BMF04 strain to different concentration of ZEN

2.4 BMF04 菌株去除ZEN 毒素的機理研究

2.4.1 BMF04 菌株活菌懸液和滅活菌懸液對ZEN 毒素的去除作用 BMF04 菌株活菌懸液在含15 μg/mL ZEN 毒素的培養基中培養48 h，HPLC 檢測峰面積為（14.29±0.77），濃度為（0.16±0.01）μg/mL，去除率為98.92%±0.07%；滅活菌懸液峰面積和毒素濃度分別（488.92±2.38）和（5.90±0.03）μg/mL（表2），去除率為60.32%±0.21%，比菌株活菌懸液的峰面積和毒素濃度明顯下降，差異顯著（P<0.05），說明去除ZEN 毒素作用是活菌生長過程中產生了具有去除ZEN 毒素作用的活性物質，高溫處理后活性物質失活，導致去除率降低[30]，高溫滅活后細胞壁依然存在，滅活后活菌的去除作用消失，細胞壁的吸附作用受溫度影響較小，因而滅活后仍然具有一定的去除率，表明BMF04菌株對ZEN 毒素的去除作用是菌株產生活性物質和細胞壁吸附的共同作用。

2.4.2 BMF04 菌株無菌發酵液和滅活無菌發酵液對ZEN 毒素的去除作用 無菌發酵液經121 ℃高溫處理后與無菌發酵液對ZEN 毒素的去除作用差異顯著（P<0.05），明顯降低（表2）。無菌發酵液與濃度為15 μg/mL 的ZEN 毒素溶液混合培養48 h 后，HPLC 檢測峰面積為（17.3±2.22），根據標準曲線計算ZEN 毒素濃度僅為（0.19±0.03）μg/mL，去除率達98.70%±0.19%；發酵液高溫處理后再與毒素溶液混合培養48 h，HPLC 檢測峰面積為（1204.75±36.29），ZEN 毒素濃度為（14.55±0.44）μg/mL（表2），去除率僅為2.09%±1.15%，去除率顯著下降（P<0.05）。說明BMF04 菌株胞外物質對ZEN 毒素具有去除作用，且高溫處理影響其去除作用。

表2 不同處理BMF04 菌株ZEN 毒素的峰面積和濃度Table 2 Peak area and concentration of ZEN by strain BMF04 with different treatments

2.4.3 BMF04 菌株細胞壁懸浮液和胞內液對ZEN毒素的去除作用 細胞壁懸浮液和胞內液在含15 μg/mL ZEN 毒素的培養基中培養48 h，測定上清液中毒素含量，計算去除率。結果表明，經細胞壁懸浮液處理的樣品峰面積分別為（27.91±0.98），ZEN 毒素濃度為（0.32±0.01）μg/mL，去除率為97.85%±0.07%（表2），說明BMF04 菌株對ZEN 毒素的去除作用有細胞壁吸附的作用。經胞內液處理的樣品峰面積為（19.12±1.06），ZEN 毒素濃度為（0.22±0.02）μg/mL，去除率為98.54%±0.10%（表2），表明BMF04 菌株對ZEN 毒素的去除作用也有菌株產生的胞內活性物質的作用。

2.4.4 蛋白酶處理對無菌發酵液去除解ZEN 毒素作用的影響 無菌發酵液經胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K 處理后對ZEN 毒素的去除作用明顯降低，差異顯著（P<0.05），反應體系中ZEN 毒素濃度分別為（3.83±0.03）、（3.95±0.02）和（3.96±0.00）μg/mL（表3），對應的去除率分別為3.52%±0.77%、0.50%±0.39%和0.18%±0.12%，未處理無菌發酵液對照ZEN 毒素峰面積為（45.44±2.37），濃度為（0.53±0.03）μg/mL，去除率為86.54%±0.72%（表3），3 種酶處理后對毒素的去除作用與對照CK1 差異顯著（P<0.05），胃蛋白酶和蛋白酶K 之間差異不顯著，其中胃蛋白酶和蛋白酶K 對BMF04菌株無菌發酵液去除ZEN 毒素的影響強于胰蛋白酶。表明胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K 能降低BMF04 菌株無菌發酵液對ZEN 毒素的去除作用，進一步說明BMF04 菌株去除ZEN毒素的胞外活性物質為蛋白類物質。

表3 不同蛋白酶處理BMF04 菌株無菌發酵液后ZEN毒素的峰面積、濃度和去除率Table 3 Peak area and concentration of ZEN culture medium after different protease treatment of aseptic fermentation broth

3 討論與結論

不同解毒微生物菌株對ZEN 毒素的降解作用和機理不同，Cho 等[17]從土壤中分離出一株降解ZEN 毒素的枯草芽孢桿菌（B.subtilis），對液體培養基和固體培養基中含1 和0.25 mg/kg ZEN 毒素的降解率分別為99%和95%；Yi 等[31]從土壤中分離得到一株能降解ZEN 毒素的地衣芽孢桿菌，在ZEN 毒素濃度為2 mg/kg 的LB 培養基中對降解率為95.8%；譚輝[32]從牛瘤胃中分離純化到假單胞屬（Pseudomonas）菌株TH-N 1，在培養基中含2 μg/mL ZEN 毒素時降解率為59%；Saumuel 等[20]分離出一株假單胞菌（Pseudomonassp.），在培養基中含0.2 μg/mL ZEN 毒素時對其降解率為90%以上。不同降解毒素菌株中芽孢菌屬降解ZEN 毒素的能力較強[18,33]，張晨曦等[34]篩選獲得一株解淀粉芽孢桿菌NS2 對5 μg/mL ZEN 的降解率高達95.99%。BMF04菌株在ZEN 毒素濃度為15 μg/mL 時，去除率仍可達為98.95%，對ZEN 毒素的去除作用明顯高于已有菌株。

不同微生物菌株降解ZEN 毒素的方式、活性物質種類不同。王國兵[35]和Xu 等[36]研究發現解淀粉芽抱桿菌ZDS-1 和香茅醇假單胞ASAG16 對ZEN毒素的去除作用是降解作用，降解過程中，沒有產生ZEN 的類似物，不是簡單的結合或吸收作用；耿海榮等[18]研究表明枯草芽孢桿菌（B.subtilis）Y-33 的菌液對2 和20 μg/mL ZEN 毒素降解率分別為93.79%和82.40%，發酵上清液對ZEN 毒素降解率為62.02%，說明該菌株降解ZEN 毒素活性成分存在于發酵上清液中；譚輝[32]對菌株TH-N 1 的降解機理研究發現活菌體細胞和細胞內含物對ZEN 的降解率分別為59%和38%，無菌的上清液和滅活后的菌液對ZEN 毒素無降解作用，說明其降解作用可能是由于細胞內的胞內酶的作用。唐彧等[37]研究認為谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamate）406 降解ZEN和AFB1 活性成分存在于發酵上清液中，降解率分別為50%和58%，初步確定其降解活性物質為一種胞外酶，而不是基于細胞壁的吸附作用。本研究結果表明BMF04 菌株對ZEN 毒素的去除作用既有細胞壁吸附作用又有蛋白質的參與，但有關降解毒素的活性物質種類待于進一步研究。

BMF04 菌株及無菌發酵液對小麥赤霉病菌和小麥雪腐鐮刀菌的菌絲生長均具有良好的抑制作用，通過細胞壁的吸附、胞內物質和胞外蛋白的降解對ZEN 毒素具有較強的去除作用，去除效果明顯高于已有菌株，該結果為菌株進一步用于去除污染糧食、飼料中的ZEN 毒素提供了新的菌種資源和理論依據。