淡竹葉多糖的大孔吸附樹脂純化工藝及對小鼠運動耐力的影響

鄧云兵，黃冬琴，岳天翔

（江西中醫藥大學，江西南昌 330038）

淡竹葉為禾本科淡竹葉屬的植物淡竹葉（Lophatherum gracileBrongn.）的莖葉，富含多糖、黃酮、多酚等生物活性物質，具有清心除煩、生津止咳的功效[1?2]，常用于涼茶、飲料等食品的生產。現代藥理學研究表明，多糖化合物可增強體內超氧化物歧化酶活性，延緩端粒縮短速度，同時提高谷胱甘肽過氧化物酶活力，使得體內過氧化物的清除速度加快，減少有害產物丙二醛的累積，具有抗衰老、抗氧化和增強機體耐力等生物學活性[3?4]，如：Xie 等發現黨參多糖可明顯延長小鼠的負重游泳時間[5]；Zhang 等通過色譜柱純化得到的斜紋夜蛾多糖可明顯降低運動后血液乳酸、尿素氮和乳酸脫氫酶的水平[6]。

運動性疲勞通常源于機體運動產生的大量活性氧自由基，使得體內發生氧化應激，造成組織損傷和肌肉收縮能力的下降[7?8]。由于目前淡竹葉多糖研究多集中于提取條件優化和抗氧化活性探討[9?10]，暫未有文獻討論其對機體運動耐力的影響，同時提取產物中仍含有蛋白質、色素等雜質，可能影響其活性的發揮，為此本研究利用大孔樹脂吸附分離具有機械篩分與化學吸附的特性[11?12]，探討其純化淡竹葉多糖提取物的最佳工藝條件，同時通過動物實驗，觀察其對小鼠運動耐力的影響，從而為相關運動食品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

淡竹葉 購自江西昌盛大藥房，經鑒定為禾本科植物淡竹葉的葉片；西洋參口服液 金日制藥（中國）有限公司；濃硫酸、苯酚、葡萄糖 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；乳酸 （Blood lactic acid,BLA）、乳酸脫氫酶 （Lactate dehydrogenase,LDH）、尿素氮 （Blood urea nitrogen,BUN）試劑盒 南京信帆生物有限公司；純化水 制于Millipore 超純水機；SPF 級健康雄性昆明小鼠 100 只，體質量15～22 g，由江西省實驗動物中心提供 （許可證號：SYXK 2018-0006）。

DX-30B 型粉碎機 廣州祥明機械設備有限公司；721 型紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；FA2104J 型電子天平 上海恒平科技有限公司；SM-150D 型超聲波細胞粉碎機 南京舜瑪科技有限公司；RE-2000A 型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；LC-10N-50A 型冷凍干燥箱 上海力辰儀器制造有限公司；TG-15 型高速離心機 四川蜀科儀器有限公司；SHA-C 型恒溫振蕩器 國華（常州）儀器制造有限公司；AB-8、H-103、D-101 型大孔樹脂 天津浩聚樹脂科技有限公司；HPD 300、HPD 400 型大孔樹脂 北京索萊寶科技有限公司；DM 301、NKA-9 型大孔樹脂 上海藍季科技發展有限公司；動物恒溫游泳池 上海艾研生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖提取物制備 淡竹葉經烘干后粉碎，過80 目篩，以水作提取溶劑，在固液比1:35 的條件下于200 W、50 ℃下，超聲提取30 min 后過濾，濾渣再次提取，合并兩次濾液，于旋轉蒸發儀中濃縮，經無水乙醇沉淀后抽濾，冷凍干燥即得[13]。

1.2.2 多糖含量測定 稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品，先后加入5%苯酚溶液和濃硫酸處理后，于490 nm 波長處測定不同濃度標準溶液的吸光度值[14]，隨后以葡萄糖質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程：y=1.013x?0.0206（r=0.9954），表明葡萄糖濃度在0.1～1.0 mg/mL范圍內，線性關系良好，另于相同波長測定樣品的吸光度，平行測定六次，通過下式計算樣品的多糖純度。

式中：c 為多糖質量濃度，mg/mL；V 為樣品溶液體積，mL；m0為樣品質量，mg；D 為稀釋倍數。

1.2.3 大孔樹脂型號篩選 經預處理后的2.0 g 不同型號樹脂置于150 mL 具塞錐形瓶內，分別加入30 mL質量濃度為5 mg/mL 多糖提取液，于25 ℃振蕩吸附12 h 后過濾，測得上清液的多糖質量濃度，通過下式計算樹脂的吸附率[15]。

式中：c0為提取液中多糖濃度，mg/mL；ce為飽和吸附后上清液中多糖濃度，mg/mL；Qe為吸附率，%。

吸附后的大孔樹脂經過濾后，加入100 mL 質量分數為80%的乙醇溶液，于相同條件靜態洗脫12 h后，測得上清液的多糖濃度，通過下式計算洗脫率與回收率[16]。

式中：c0為提取液中多糖濃度，mg/mL；ce為飽和吸附后上清液中多糖濃度，mg/mL；cd為洗脫液中多糖濃度，mg/mL；V0為提取液體積，mL；Vd為洗脫液體積，mL；Dd為洗脫率，%；R 為回收率，%。

1.2.4 樹脂靜態吸附-解吸動力學曲線 將預處理后的2.0 g AB-8 型大孔樹脂置于150 mL 具塞錐形瓶內，加入30 mL 質量濃度為5 mg/mL 多糖提取液后振蕩吸附，于不同時間測定上清液的多糖濃度后，繪制靜態吸附曲線，隨后過濾，另加入100 mL 體積分數為80%的乙醇溶液，振蕩洗脫，測得不同時間上清液的多糖質量濃度，繪制樹脂的靜態洗脫曲線，另利用用不同動力學模型研究AB-8 型樹脂對淡竹葉多糖的吸附機制。

式中：K1為準一級速率常數，min?1；K2為準二級速率常數，mL?mg?1·min?1；τt為多糖吸附量，mg/g；τe為多糖飽和吸附量，mg/g。

1.2.5 樹脂動態吸附-洗脫條件考察

1.2.5.1 不同吸附條件考察 分別考察上樣質量濃度、樣液pH、上樣體積及上樣流速對樹脂的吸附率影響，具體如下：當樣液pH 為5.0，上樣流速為2 mL/min，上樣液體積為60 mL 時，上樣質量濃度分別為：1、3、5、7、9 mg/mL；當上樣質量濃度為5 mg/mL，上樣流速為2 mL/min，上樣液體積為60 mL 時，樣液pH 分別為：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；當上樣質量濃度為5 mg/mL，樣液pH 為5.0 時，繪制上樣流速分別為1、2、3 mL/min 的泄漏曲線。

1.2.5.2 不同洗脫條件考察 以乙醇溶液作洗脫液，分別考察洗脫液體積分數、體積和洗脫流速對目標化合物解吸的效果影響，具體如下：當洗脫流速為1 mL/min，洗脫液體積160 mL 時，洗脫液體積分數分別為50%、60%、70%、80%、90%；當洗脫液體積分數80%時，繪制洗脫流速分別為1、2、3 mL/min時洗脫曲線。

1.2.6 動物實驗

1.2.6.1 分組與劑量設計 100 只健康雄性小鼠適應性喂養7 d 后（飼養環境溫度：20～25 ℃，相對濕度：50%～70%），按體質量隨機分為5 組，即空白對照組、陽性對照組和低、中、高劑量組，每組各20 只，根據《保健食品功能評價》要求，設計人體推薦攝入劑量的10、20、30 倍，作為低、中、高劑量組動物每日淡竹葉多糖純化物的攝入量，即0.10、0.20、0.30 mg/g/d，空白對照組則給予生理鹽水，陽性對照組則給予西洋參口服液（2 mg/mL），各組動物均按照0.2 mL/g 體重灌胃，全部動物每天灌胃1 次，連續灌胃30 d，灌胃期間可自由喂食與飲水[17?18]。

1.2.6.2 力竭游泳時間 末次灌胃后，各組動物于鼠尾負重5%體質量重物，置于（25±2）℃游泳池內開展負重游泳試驗，記錄小鼠自入水開始游泳至沉沒超過10 s 的時間[19]。

1.2.6.3 生化指標測定 末次灌胃結束后，各組剩余動物游泳30 min，取出擦凈，休息10 min 后，于眼底取血，離心，制備血清，照相關試劑盒說明書要求，檢測各組小鼠血清中BLA 與BUN 的含量及LDH活力[20]。

1.3 統計學處理

實驗數據采用均數±標準差描述，利用SPSS 19.0 進行單因素方差分析，不同組間的比較采用方差分析，檢驗水準α=0.05，當P<0.05 判斷為差異顯著，P<0.01 判斷為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂型號確定

不同型號的樹脂的比表面積和極性不同，因此對目標化合物的吸附與解吸效果存在較大差異，分別考察不同類型大孔樹脂的吸附與解吸效果，結果見表1。從表1可見，H 103 型大孔樹脂對多糖化合物的解吸率僅為51.6%，這歸因于該樹脂的比表面積較大，吸附位點較多，而多糖化合物具有弱極性，因此較難解吸，HPD-300 型大孔樹脂的吸附率雖達到88.2%，但解吸率僅為68.6%，而AB-8 型大孔樹脂比表面積適中，且回收率達到74.5%，因此確定采用AB-8 型大孔樹脂純化淡竹葉多糖提取物。

表1 不同類型大孔樹脂的吸附與解吸效果Table 1 Adsorption and desorption performance of different types of macroporous resins

2.2 樹脂靜態吸附與解吸動力學曲線

圖1為AB-8 型大孔樹脂的靜態吸附曲線，從圖1可知，該吸附過程為中速平衡型，在前4 h 樹脂的吸附率增長較快，隨后逐漸緩慢，至8 h 后基本不再變化達到平衡，因此該樹脂對淡竹葉多糖的靜態吸附時間為8 h。圖2為AB-8 型大孔樹脂的靜態洗脫曲線，從圖2可知，該解吸過程為快速平衡型，前3 h洗脫率迅速增大，隨后趨于穩定，達到平衡。采用一級和二級動力學模型分別擬合上述吸附過程，結果見表2。從表2可知，采用二級動力學模型擬合方程的相關系數較大，因此該吸附過程更接近于二級動力學模型特征，吸附過程可能受到外部擴散、邊界層擴散或顆粒內擴散控制。

表2 吸附動力學模型擬合參數Table 2 The fitting parameters of adsorption kinetics models

圖1 靜態吸附動力學曲線Fig.1 The static adsorption kinetics curve

圖2 靜態解吸動力學曲線Fig.2 The static desorption kinetics curve

2.3 上樣質量濃度對吸附效果的影響

不同上樣質量濃度對樹脂吸附率的影響，見圖3所示。從圖3可見，隨著上樣質量濃度的增大，樹脂的吸附率先升高后降低，這歸因于當上樣質量濃度較低時，樹脂的吸附位點較多，而隨著濃度不斷增大，樣品中雜質的含量亦逐漸增加，不僅易堵塞樹脂，同時可與目標化合物競爭吸附活性位點[21]，因此確定最佳上樣質量濃度為5 mg/mL。

圖3 上樣液質量濃度對吸附率的影響Fig.3 Effect of sample concentration on the adsorption rate

2.4 樣液pH 對吸附效果的影響

不同樣液的pH 對樹脂吸附率的影響，見圖4。從圖4可知，隨著樣液pH 的升高，樹脂對多糖的吸附率呈先升高后降低的趨勢，當樣液pH 為5.0 時，吸附率達到最大，這可能源于多糖類化合物在酸、堿條件下均易發生水解反應，從而影響目標化合物的溶解度與化學性質[22]，而溶液處于弱酸性時，多糖更易于被樹脂吸附，這與陳艷等利用大孔樹脂純化松茸多糖研究結論一致[23]，因此確定樣液最佳pH 為5.0。

圖4 樣液pH 對吸附率的影響Fig.4 Effect of pH value of sample solution on the adsorption rate

2.5 上樣流速對吸附效果的影響

隨著上樣液體積的不斷增大，樹脂的吸附位點逐漸飽和，從而吸附能力不斷下降，使得流出液中多糖濃度持續升高，若流出液中多糖濃度約為上樣質量濃度的10%，則認為樹脂已吸附飽和并出現泄漏[24]，若上樣液體積過大且流速過快，不僅使得目標化合物無法與樹脂充分接觸，也容易出現樹脂過載，因此分別考察不同上樣流速的樹脂泄露曲線，結果見圖5。從圖5可知，隨著上樣液體積的增多，流出液中多糖濃度不斷增大，樹脂最終達到飽和吸附，另外隨著流速加快，樹脂開始泄漏時的上樣液體積不斷減少，結合實際吸附效率，確定最佳上樣流速為2.0 mL/min，上樣液體積為60 mL。

圖5 不同上樣流速的泄漏曲線Fig.5 The leakage curve in different loading speed

2.6 乙醇體積分數對解吸效果的影響

圖6為不同洗脫液體積分數對洗脫率的影響，當洗脫液體積分數增大至80%后，洗脫率開始下降，這歸因于洗脫液的體積分數過低或過高，其極性均與目標化合物相差較大，不能破壞樹脂與多糖形成的氫鍵[25]，同時其它吸附雜質也會競爭脫附，致使洗脫率降低，因此確定洗脫液的體積分數為80%。

圖6 洗脫液體積分數對洗脫率的影響Fig.6 The effect of volume fraction of eluent on the desorption rate

2.7 洗脫流速對解吸效果的影響

洗脫流速過快會使洗脫液與樹脂接觸不充分，為此考察飽和吸附后的樹脂在不同洗脫流速下的解吸曲線，結果見圖7。從圖7可知，洗脫流速過大，曲線峰型逐漸變寬、拖尾嚴重，且用量增多，當采用80%乙醇以1.0 mL/min 流速洗脫飽和吸附樹脂后，洗脫曲線單一、對稱、尖銳，且無明顯拖尾，因此確定最佳洗脫流速為1.0 mL/min，洗脫液用量160 mL。

圖7 不同洗脫流速的解吸曲線Fig.7 The dynamic desorption curve in different flow rate of elution

2.8 最佳工藝驗證

按照上述試驗確定的最佳純化工藝，即配制體積為60 mL，pH5，質量濃度為5 mg/mL 的淡竹葉多糖溶液，以2.0 mL/min 流速，上樣至AB-8 型大孔樹脂飽和吸附后，采用體積為160 mL 80%乙醇溶液，以1.0 mL/min 流速洗脫，產物的多糖純度由16.39%±1.06%提高至 57.37%±1.72%，約為純化前3.5 倍。

2.9 淡竹葉多糖對小鼠運動耐力的影響

2.9.1 淡竹葉多糖對力竭游泳時間影響 負重游泳試驗是考察動物運動耐力的常用模型，通過力竭游泳時間的測定，可客觀反映淡竹葉多糖對機體疲勞緩解的效果，各組小鼠的力竭游泳時間結果見表3。從表3可知，與空白對照組相比，中、高劑量組和陽性對照組均顯著延長動物的力竭游泳時間，其中，中劑量組差異顯著（P<0.05），而高劑量組和陽性對照組差異極顯著（P<0.01），表明中、高劑量淡竹葉多糖有助于提高機體的運動耐力，延長運動時間，另外高劑量組與陽性對照組具有極顯著性差異（P<0.01）。

表3 淡竹葉多糖對小鼠力竭游泳時間的影響Table 3 The effect of polysaccharides of Lophatherum gracile Brongn.on exhaustive swimming time of mice

2.9.2 淡竹葉多糖對BLA 和LDH 的影響 高強度運動時體內供氧不足，部分血糖轉化成乳酸，造成四肢肌肉酸痛，而乳酸脫氫酶有利于催化乳酸脫氫形成丙酮酸，減少體內乳酸累積[26]，淡竹葉多糖對運動后小鼠血清BLA 和LDH 的影響，見表4。從表4可知，與空白對照組相比，中、高劑量組與陽性對照組小鼠的BLA 濃度均顯著低于空白對照組（P<0.05,P<0.01），而LDH 活力則有顯著提高 （P<0.05,P<0.01），表明中、高劑量淡竹葉多糖有利于明顯增強乳酸脫氫酶活力，減小體內乳酸含量，高劑量組BLA 濃度和LDH 活力較陽性對照組具有顯著性差異 （P<0.05）。

表4 淡竹葉多糖對BLA 和LDH 的影響Table 4 The effect of polysaccharides of Lophatherum gracile Brongn.on BLA and LDH

2.9.3 淡竹葉多糖對體內尿素氮含量影響 當機體劇烈運動，血糖供應不足，超出體力負荷承載能力時，體內蛋白質和氨基酸分解代謝加快，以補充額外能量，使得代謝產物尿素氮含量迅速增大[27]，淡竹葉多糖對運動后小鼠血清尿素氮含量的影響見表5。從表5可知，與空白對照組相比，中、高劑量組與陽性對照組小鼠的BUN 濃度均顯著低于空白對照組（P<0.05,P<0.01），表明中、高劑量組可減少運動時體內蛋白質的分解利用，但高劑量組的BUN 濃度與陽性對照組相較，差異具有顯著性 （P<0.05）。

表5 淡竹葉多糖對BUN 的影響Table 5 The effect of polysaccharides of Lophatherum gracile Brongn.on BUN

3 結論

隨著對可食用性植物有效成分的生物活性研究不斷深入，諸如：多糖、黃酮、皂苷類物質，被發現對活性氧自由基具有較強清除能力，而機體劇烈運動易導致活性氧自由基積累，引發軀體性疲勞，為此本研究探討了大孔樹脂純化淡竹葉多糖的最佳工藝條件并分析其對小鼠的運動耐力影響。當配制體積為60 mL，pH5，質量濃度為5 mg/mL 的淡竹葉多糖溶液，以2 mL/min 流速，上樣至AB-8 型大孔樹脂飽和吸附后，采用體積為160 mL 80%乙醇溶液，以1 mL/min 流速洗脫，產物的多糖純度由16.39%提高至57.37%，約為純化前3.5 倍。孫偉曾采用D101大孔樹脂純化桑白皮多糖，產物純度約為純化前4.6 倍[28]，而張洪坤曾采用AB-8 大孔樹脂純化茯苓多糖，產物純度為約為純化前3.2 倍[29]，表明該工藝分離純化效果較好，適于淡竹葉多糖提取物的純化。從動物實驗結果可知，淡竹葉多糖的劑量與增強小鼠運動耐力呈正相關，隨著多糖劑量的增大，有助于延長小鼠的游泳力竭時間，提高體內乳酸脫氫酶活性，從而加快體內乳酸代謝，減小對機體內環境穩態的影響，同時避免了蛋白質與氨基酸的分解代謝，這與焦迎春等研究柴達木大肥菇多糖的抗疲勞活性結果基本一致[30]。本研究可為淡竹葉多糖增強機體運動耐力的功能性食品開發提供參考，促進該資源的開發利用，但其具體的抗疲勞機制和人體安全劑量尚需進一步研究。