響應面優化超聲波輔助酶法提取油莎豆ACE抑制肽的工藝

殷海洋，劉振春，張世康，安 琪

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118）

油莎豆（Cyperus esculentus）因細長的根系頂端長有形狀似豆的塊莖而得名，屬禾本科一年生植物，原產于非洲及地中海沿岸國家。油莎豆擁有極強的適應生存能力，于1960年被我國引進并大面積種植，主要分布于黑龍江、北京、河北、湖南、山東、四川等地[1?2]。油莎豆的主要成分是油脂及淀粉，占比達55%，此外還含有約10%的蛋白質。油莎豆蛋白中含17 種氨基酸，營養極為豐富且消化率極高，其中70.59%的蛋白可被胃蛋白酶直接消化吸收，是一種利用價值超過小麥、玉米的高價值糧食作物[3?6]。

血管緊張素轉化酶（ACE）是一種對血壓有升高作用的酶，主要存在于動物肺部組織。ACE 可通過催化血管緊張素I 轉化為血管緊張素II，促進血管收縮引起血壓升高[7?8]，還可使人體內舒緩肌肽失活，阻礙血管舒張，從而使血壓升高。而ACE 抑制肽是一種可以有效抑制ACE 生理活動、降低血壓的多肽物質，它與ACE 間存在極強的相互作用，可以限制血管緊張素I 向血管緊張素II 轉化[9?12]。近年來有很多研究者從核桃、綠豆等植物中提取ACE 抑制肽并用于治療高血壓，都表現出明顯的效果[13?15]。

我國對油莎豆ACE 抑制肽的制備和研究處于起步階段，主要集中在研究油莎豆的種植和成分分析。利用超聲波輔酶法提取油莎豆ACE 抑制肽未見報道，對油莎豆的利用和開發有重要意義[16]。本研究利用響應面法優化超聲波輔助酶法提取油莎豆ACE 抑制肽工藝，以期為油莎豆ACE 抑制肽進一步研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油莎豆 吉林農大外農貿市場售；堿性蛋白酶（100 U/mg）、中性蛋白酶（200 U/mg）、胃蛋白酶（200 U/mg）、木瓜蛋白酶（100 U/mg） 北京奧博星生物技術有限公司；血管緊張素轉化酶、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL） Sigma 公司。

JY99-2D 超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；LG0.2 真空冷凍干燥機 沈陽航天新陽速凍設備制造有限公司；LXJ-ⅡB 離心機 上海安亭科學儀器廠；SHA-B 水浴恒溫振蕩器 金壇市醫療儀器廠；SPD-20A UVmini-1240 紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 油莎豆蛋白等電點的測定 將霉變和有蟲洞的油莎豆篩除后粉碎、用石油醚浸泡脫脂、干燥過80 目篩。稱取油莎豆粉20 g，按1:15（g/mL）加入蒸餾水混合，45 ℃水浴。用1 mol/L NaOH 調pH 為9.0，攪拌1 h，5000 r/min 離心10 min 后，將上清液均分成6 組。用1 mol/L HCl 溶液將上述6 組上清液pH 分別調為3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8，靜置30 min 后5000 r/min 離心10 min，取沉淀物稱重，以沉淀質量最大值時的pH 為油莎豆蛋白等電點[17]。

1.2.2 ACE 抑制率測定 采用Cushman 檢測方法[18]，在4 mL EP 管中先加入200 μL 馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）溶液，再加入50 μL ACE 抑制劑，混合后置于37 ℃恒溫水浴鍋中水浴5 min，然后再加入50 μL ACE 溶液。37 ℃水浴條件下保持40 min，將1 moL/L HCl 溶液作為終止劑，向上述溶液中加入200 μL HCl 溶液迅速降低pH 終止反應。再向試管中加入1.2 mL 乙酸乙酯搖勻混合約15 s，5000 r/min 離心10 min 吸取0.8 mL 脂層溶液，120 ℃烘干30 min。烘干后白色晶體加入3 mL 的去離子水溶解，用紫外分光光度計測定波長為228 nm 處吸光值。

ACE 抑制率測定步驟見表1，計算公式如下：

表1 ACE 抑制率的測定步驟Table 1 Determination of ACE inhibition rate

式中：A1：ACE 抑制肽和ACE 都存在的溶液吸光度值；A2：不加ACE 抑制肽的溶液吸光度值；A3：ACE 與HHL 存在的空白溶液吸光度值。

1.2.3 油莎豆蛋白質提取 將霉變和有蟲洞的油莎豆篩除后粉碎、用石油醚浸泡脫脂、干燥過80 目篩。按1:15 （g/mL）加入蒸餾水混合均勻，用0.5 mol/L NaOH 將pH 調至9.0 攪拌提取1 h，5000 r/min 離心10 min，取上清液。再將上清液用0.5 mol/L HCl滴定至等電點（pH4.2），靜置30 min 后5000 r/min 離心10 min，沉淀用蒸餾水反復洗至中性，冷凍干燥48 h。密封在?20 ℃冰箱中保存[19]。

1.2.4 超聲波輔助酶法制備油莎豆ACE 抑制肽工藝 取5 g 油莎豆粗蛋白，按料液比1:10 加入蒸餾水。180 W 超聲處理20 min，用0.5 mol/L NaOH 調節pH 到9，水浴至恒溫45 ℃后加入5000 U/g 的蛋白酶，酶解3 h。將溫度提升至90 ℃維持15 min 滅酶，冷卻至室溫再將酶解液pH 調至等電點（4.2），5000 r/min 離心20 min，取上清液冷凍干燥[20]。

1.2.5 蛋白酶的篩選 油莎豆粗蛋白為底物，選取中性蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶4 種酶在最適條件下對油莎豆粗蛋白進行酶解[21]。底物濃度3%，加酶量5000 U/g，酶解時間3 h。將溫度提升至90 ℃維持15 min 滅酶，冷卻至室溫再將酶解液pH 調至等電點（4.2），5000 r/min 離心20 min，收集上清液，測其ACE 抑制率。

1.2.6 單因素實驗

1.2.6.1 底物濃度對油莎豆ACE 肽抑制率的影響制備底物濃度為1%、2%、3%、4%、5%（m/v）的油莎豆粗蛋白溶液。180 W 超聲處理20 min，將pH 調至9，酶解溫度45 ℃，加酶量5000 U/g，酶解時間3 h。測定底物濃度對酶解液ACE 抑制率的影響。

1.2.6.2 超聲處理時間對油莎豆ACE 肽抑制率的影響 配制底物濃度為3%（m/v）的蛋白質溶液，超聲功率180 W，將超聲處理時間設定為10、15、20、25、30 min。將pH 調至9，酶解溫度45 ℃，加酶量5000 U/g，酶解時間3 h。測定超聲處理時間對油莎豆ACE 肽抑制率的影響。

1.2.6.3 超聲功率對油莎豆ACE 肽抑制率的影響配制底物濃度為3%（m/v）的蛋白質溶液,分別在超聲功率為0、60、120、180、240 W，超聲處理20 min。將pH 調至9，水浴溫度45 ℃，加酶量5000 U/g，酶解時間3 h。測定超聲功率對油莎豆ACE 肽抑制率的影響。

1.2.6.4 酶解溫度對油莎豆ACE 肽抑制率的影響配制底物濃度為3%（m/v）的蛋白質溶液，180 W 超聲處理20 min。將pH 調至9，分別設定酶解溫度為40、45、50、55、60 ℃，加酶量5000 U/g，酶解時間3 h。測定酶解溫度對油莎豆ACE 肽抑制率的影響。

1.2.6.5 酶解時間對油莎豆ACE 肽抑制率的影響配制底物濃度為3%（m/v）的蛋白質溶液，180 W 超聲處理20 min。將pH 調至9，酶解溫度45 ℃，加酶量5000 U/g，酶解時間分別選取為1、2、3、4、5 h。測定酶解時間對油莎豆ACE 肽抑制率的影響。

1.2.6.6 加酶量對油莎豆ACE 肽抑制率的影響 配制底物濃度為3%（m/v）的蛋白質溶液，180 W 超聲處理20 min。將pH 調至9，酶解溫度45 ℃，加酶量分別選取為3000、4000、5000、6000、7000 U/g，酶解時間3 h。測定加酶量對油莎豆ACE 肽抑制率的影響。

1.3 響應面優化試驗

根據Box-Benhnken 試驗設計原理，以油莎豆ACE 抑制率為響應變量，從單因素實驗結果中選取3 個對油莎豆ACE 抑制率影響最大的因素，見表2。以ACE 抑制率為指標優化酶解溫度、超聲功率、酶解時間。

表2 響應面分析因素及水平Table 2 Response surface analysis factors and levels

1.4 數據處理

所有試驗均重復三次，取平均值。單因素實驗采用Origin2018 軟件繪圖，數據以“平均值±標準差”來表示；采用Design Expert8.0.6 軟件進行響應面試驗設計與分析。

2 結果與分析

2.1 油莎豆蛋白等電點的確定

油莎豆等電點測定結果如圖1所示，在pH3.8～4.2 時，蛋白質得率增加；在pH4.2～4.8 時，蛋白質得率降低，因此提取油莎豆蛋白最佳pH 為4.2。

圖1 油莎豆蛋白等電點的測定Fig.1 Determination of the isoelectric point of Cyperus esculentus protein

2.2 蛋白酶的選擇

選用4 種蛋白酶對油莎豆蛋白進行酶解，測定其抑制率，結果如表3所示。其中堿性蛋白酶的ACE 抑制率最高，為74.45%，因此堿性蛋白酶為油莎豆粗蛋白最適酶解用酶。

表3 四種蛋白酶對油莎豆ACE 抑制肽的抑制率的影響Table 3 Influence of four proteases on the inhibition rate of Cyperus esculentus ACE inhibitor peptide

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 底物濃度對油莎豆ACE 肽抑制率的影響 由圖2可知，當蛋白質濃度為1%～3%時，ACE 抑制率隨著底物濃度的增加而增加；底物濃度為3%時ACE 抑制率達到最大值74.29%；底物濃度超過3%時，ACE 抑制率開始降低。底物濃度的多少直接決定了ACE 抑制肽的含量，從而影響了ACE 與ACE 抑制肽間相互作用機率的大小及傳質速度。底物濃度較小即ACE 抑制肽含量較少時，溶液濃度較低二者相互接觸更加容易，所以ACE 抑制率隨底物濃度的增加而增大。但底物濃度過高時ACE 抑制肽濃度也隨之增大，此時ACE 抑制肽之間可能會出現團聚現象，減小了其與ACE 間可接觸作用的表面積。此時表現為ACE抑制率隨底物濃度增加而減小[22?23]。因此，選擇底物濃度為3%。

圖2 底物濃度對油莎豆ACE 肽抑制率的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on the inhibition rate of Cyperus esculentus ACE peptide

2.3.2 超聲處理時間對油莎豆ACE 肽抑制率的影響 由圖3可知，隨超聲時間增長，ACE 抑制率先增加后降低。超聲時間為20 min 時，ACE 抑制率達到最大值74.03%。適當時間的超聲處理可破壞細胞壁釋放胞內物質給蛋白酶提供更多的酶切位點，超聲時間過長有可能將蛋白質結構破壞，影響ACE 抑制肽的提取，降低其抑制率。因此，選擇超聲時間為20 min。

圖3 超聲處理時間對油莎豆ACE 肽抑制率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on inhibition rate of Cyperus esculentus ACE peptide

2.3.3 超聲功率對油莎豆ACE 肽抑制率的影響 由圖4可知，隨著超聲功率的增加，ACE 抑制率先增加后降低，超聲功率為180 W 時，ACE 抑制率達到最大值74.52%。適當的超聲功率能夠破壞細胞壁，為蛋白酶提供更多的酶切位點。因此，選擇超聲功率為180 W。

圖4 超聲功率對油莎豆ACE 肽抑制率影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the inhibition rate of Cyperus esculentus ACE peptide

2.3.4 酶解溫度對油莎豆ACE 肽抑制率的影響 由圖5可知，隨著酶解溫度的升高，ACE 抑制率先增加后降低，酶解溫度為45 ℃時，ACE 抑制率達到最大值74.60%。當溫度繼續升高時，會導致蛋白質變性蛋白酶失活，酶解度下降，ACE 抑制肽含量降低，ACE 抑制率減少[24]。因此，選擇酶解溫度為45 ℃。

圖5 酶解溫度對油莎豆ACE 肽抑制率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the inhibition rate of Cyperus esculentus ACE peptide

2.3.5 酶解時間對油莎豆ACE 肽抑制率的影響 由圖6可知，前3 h 隨酶解時間的增加，ACE 抑制率逐漸增加。3 h 后，ACE 抑制率趨于平緩，這可能是時間過長導致蛋白酶活性降低或底物量不足導致反應終止。酶解時間3 h 時，ACE 抑制率為最大值74.48%。因此，選擇酶解時間為3 h。

圖6 酶解時間對油莎豆ACE 肽抑制率的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on the inhibition rate of Cyperus esculentus ACE peptide

2.3.6 加酶量對油莎豆ACE 肽抑制率的影響 由圖7可知，隨加酶量的增加，ACE 抑制率逐漸增加后平穩，加酶量5000 U/g 時，ACE 抑制率達到最大值74.13%。因此ACE 抑制率并不會隨著加酶量增高而不斷變高，而是達到峰值后趨于穩定。為了節約生產成本，選擇加酶量為5000 U/g。

圖7 加酶量對油莎豆ACE 肽抑制率的影響Fig.7 Effect of enzyme addition on the inhibition rate of Cyperus esculentus ACE peptide

2.4 響應面優化試驗

根據單因素實驗結果，影響油莎豆ACE 抑制率最大的主要因素有：酶解時間（A）、酶解溫度（B）、超聲功率（C），利用Box-Behnken 中心組合試驗進行三因素三水平試驗，對酶解條件進行優化。響應面試驗結果見表4，方差分析結果見表5。

2.4.1 回歸方程的建立與檢驗 利用Design Expert 8.0.6 軟件對表4中的實驗數據進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸程：Y=+74.29+0.41A?0.50B+0.049C?0.27AB+0.095AC?0.43BC?1.73A2?2.67B2?0.97C2。

表4 Box-Behnken 試驗設計及其結果Table 4 Box-Behnken experimental design and results

由表5可知，模型P<0.0001，模型的決定系數R2=0.9646，調整系數R2adj=0.9845，說明該模型的擬合度很好。三個因素的顯著性影響大小依次為：酶解溫度>酶解時間>超聲功率。

表5 響應面方差分析結果Table 5 Response surface analysis of variance results

2.4.2 雙因素的交互作用 等高線圖可以直觀地反映兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示交互作用顯著。

如圖8所示，酶解時間與溫度的交互作用三維立體圖的等高線圖為圓形，所以酶解時間與溫度的交互作用不顯著。

圖8 酶解時間與酶解溫度的交互作用Fig.8 Interaction between enzymolysis time and enzymolysis temperature

如圖9所示，超聲功率與酶解時間的交互作用三維立體圖的等高線圖為圓形，所以超聲功率與酶解時間的交互作用不顯著。

圖9 超聲功率與酶解時間的交互作用Fig.9 Interaction between ultrasonic power and enzymolysis time

如圖10所示，超聲功率與溫度的交互作用三維立體圖的等高線圖為橢圓，所以超聲功率與溫度的交互作用顯著。

圖10 超聲功率與酶解溫度的交互作用Fig.10 Interaction between ultrasonic power and enzymolysis temperature

2.4.3 最佳制備參數的確認及驗證 通過Design Expert8.0.6 軟件進行工藝參數的優化組合，得到堿性蛋白酶酶解油莎豆蛋白制備ACE 抑制肽的最佳工藝條件為：底物濃度3%、超聲功率180 W、超聲處理時間20 min、加酶量5000 U/g、酶解溫度45 ℃、酶解時間3 h，預測此條件下ACE 抑制率為74.45%。按照上述最佳條件進行三次驗證試驗，得到ACE 抑制率的平均值為74.16%。基本接近試驗所獲得的理論值，表明預測值和真實值之間有很好的擬合性，因此本研究中利用響應面法獲得的優化工藝參數準確可靠。

3 結論

本實驗在單因素實驗的基礎上用響應面法優化了油莎豆ACE 抑制肽的提取工藝，確定了超聲輔助堿性蛋白酶法提取ACE 抑制肽的最佳條件:超聲處理時間20 min、溫度45 ℃、超聲功率180 W、底物濃度3%、加酶量5000 U/g、酶解時間3 h，此條件下油莎豆ACE 抑制肽的抑制率為74.16%。其中對最終提取效果影響較大的因素是酶解時間、超聲功率、溫度，因此提取過程本質上的影響因素可以歸結為酶活性的高低以及酶活性位點與蛋白結合的難易程度。本研究對酶法提取ACE 抑制肽工藝具有一定的參考價值，但是ACE 抑制實驗中的抑制率還存在較大的上升空間仍需繼續探索。