響應面法優化富含魚骨鈣低溫魚肉香腸配方

王禹赫，巴吐爾·阿不力克木，瑪日耶姆古麗·庫爾班，李 娜

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 830052）

低溫魚肉香腸是以魚糜為主要材料，同時添加其他輔料，制作的高蛋白、低脂肪和低固醇的營養型肉制品[1]，因其質地緊實、細膩，味道鮮美，營養全面豐富而受到消費者歡迎[2]。草魚在我國養殖產量位居第一，約占淡水魚總量1/5[3]。但草魚肉容易氧化變質，不可長期保存[4]。因此，魚糜制品既滿足了人們對于高蛋白的營養追求，又可以保證魚肉在一定時間內不變質。目前，國內現有水產加工企業因缺乏精深加工技術，僅利用了魚肉部分，忽略了營養同樣豐富的魚骨刺[5],魚骨刺直接丟棄或魚粉廠低價收入制成動物飼料、肥料等低附加值產品。不僅造成環境污染和資源大量浪費，同時使企業利潤降低。因此，如何利用魚骨成為高附加值產品，具有一定研究意義。

魚骨刺中含有豐富的蛋白質、鈣和磷等營養成分[6]，且魚骨中鈣磷含量比例合理，易被人體所吸收[7]，應用于食品中，可以增加產品的營養成分，提升產品營養價值。王正云等[8]將魚骨等下腳料應用到醬油的制作當中，所制醬油香味濃厚，口感鮮美，符合國家二級醬油標準；范鴻兵等[9]運用螯合工藝將鰱魚魚骨制備膠原多肽螯合鈣；霍健聰等[10]通過堿醇法制備出鱈魚魚骨鈣片；劉鐵玲等[11]將鰱魚頭混合黃豆醬等輔料制作成含鈣物質豐富的鮮辣醬。但目前將魚骨酶解，經微細粉碎制成骨粉添加魚糜制品的研究還鮮有報道。魚糜制品是當今社會的新型魚肉加工制品，具有高蛋白，低脂，食用攜帶便捷等優點[12]。

本研究以草魚肉為原材料，研究食鹽、魚骨粉及玉米淀粉對魚肉低溫香腸質構特性、感官指標和蒸煮損失的影響，并通過響應面試驗確定三種添加物的最佳添加量，期望研發出富含魚骨鈣的功能型肉制品，為我國肉制品研發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮草魚 新疆烏魯木齊市新北園春農貿市場，食鹽、孜然粉、姜粉、白砂糖、玉米淀粉 新疆烏魯木齊市沙依巴克區友好生活超市；膠原蛋白腸衣（直徑18 mm） 廣東德福隆生物技術有限公司；三聚磷酸鈉、焦磷酸鈉、六偏磷酸鈉 食品級，河南萬邦實業有限公司；木瓜蛋白酶（100000 U/g） 食品級，南寧龐博生物工程有限公司。

12 型臺式電動絞肉機 上海賽璞有限公司；手動式灌腸器 廣東德福隆生物技術有限公司；C21-HT2117HM 電磁爐 廣東美的生活電器制造有限公司；LE204E/02 型電子天平 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；DZ-400/2 真空包裝機 溫州奔騰有限公司；TA-XT2i 型質構儀 英國Stable Micro Systems 公司；HH-S4 恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚骨粉的制備工藝 前處理：魚骨經高溫蒸煮方式，使魚骨上附著魚肉呈凝膠化后使用清水沖洗掉；去油脂：沖洗后的魚骨刺在20%異丙醇溶液中，55 ℃條件下浸泡10 h，異丙醇溶液體積淹沒魚骨為宜；酶水解：將去脂后沖洗干凈的魚骨放入燒杯，按料液比1:15 加水，調節pH7.0 條件下加入木瓜蛋白酶，加酶量控制其酶活為2000 U/g，并在55 ℃下酶解魚骨3 h；高壓蒸煮：酶解后的魚骨在121 ℃、0.1 MPa 條件下蒸煮30 min，對木瓜蛋白酶滅活處理，同時起到進一步去除魚骨刺表面多余雜質；干燥粉碎：高壓蒸煮后流水沖洗干凈，烘干水分，使用高速粉碎機將魚骨粉碎至過200 目篩無殘留即得魚骨粉。

1.2.2 低溫魚肉香腸制作工藝流程 草魚肉進行絞制，使魚肉呈現魚糜狀；添加食鹽，磷酸鹽等腌制劑混合均勻，4 ℃條件下腌制20 h；腌制結束后，添加魚骨粉，白砂糖等食用添加劑進行二次攪拌，攪拌過程中不斷添加冰水，保證魚糜溫度在4 ℃范圍內；攪拌好的魚糜灌入腸衣，排除腸衣內部空氣；75 ℃條件下烘烤1 h，80 ℃條件下蒸煮30 min；冷卻，晾干水分采用真空包裝；4 ℃條件下保存待測。

1.2.3 單因素實驗設計

1.2.3.1 食鹽添加量的優化 控制在添加復配磷酸鹽0.5%、孜然粉0.3%、姜粉0.5%、白砂糖3.0%、冰水20.0%、魚骨粉1.5%和玉米淀粉6.0%的條件下，分別添加食鹽0、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%制作低溫魚肉香腸，通過對香腸的質構（硬度、彈性、咀嚼性、內聚性）、感官評分和蒸煮損失率的分析，確定最佳食鹽添加量。

1.2.3.2 魚骨粉添加量的優化 控制在添加食鹽1.5%、復配磷酸鹽0.5%、孜然粉0.3%、姜粉0.5%、白砂糖3.0%、冰水20.0%和玉米淀粉6.0%的條件下，分別添加魚骨粉0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%制作低溫魚肉香腸，通過對香腸的質構（硬度、彈性、咀嚼性、內聚性）、感官評分和蒸煮損失率的分析，確定最佳魚骨粉添加量。

1.2.3.3 玉米淀粉添加量的優化 控制在添加食鹽1.5%、復配磷酸鹽0.5%、孜然粉0.3%、姜粉0.5%、白砂糖3.0%、冰水20.0%和魚骨粉1.5%的條件下，分別添加玉米淀粉0、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%制作低溫魚肉香腸，通過對香腸的質構（硬度、彈性、咀嚼性、內聚性）、感官評分和蒸煮損失率的分析，確定最佳玉米淀粉添加量。

1.2.4 響應面優化試驗設計 響應面試驗在前期單因素實驗結果基礎上，設置食鹽、魚骨粉和玉米淀粉添加量為自變量因素，選擇感官評分和蒸煮損失率為響應值，采用Box-Behnken 設計出3 因素3 水平響應面試驗，探究食鹽、魚骨粉和玉米淀粉對魚肉低溫香腸感官評分及蒸煮損失的影響，確定三種添加物的最佳添加量，響應面試驗設計如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.5 指標測定

1.2.5.1 質構測定 參考榮建華等[13]試驗方案，略作調整，利用質構儀對低溫魚肉香腸的硬度、彈性、咀嚼性和內聚性進行分析，香腸切成1.5 cm 的圓柱體，采用TPA（Texture Profile Analysis）模式和P/36 R探頭，測前、測后速率均為2 mm/s，測中速率1 mm/s，壓縮比30%，每組樣品平行測定9 次。

1.2.5.2 感官品質評價 將樣品切成直徑18 mm，高10 mm 的圓柱體，邀請本院食品專業研究生10 名，經相關專業知識與細則學習后，對低溫魚肉香腸進行感官品質評價，每組樣品評定前均漱口，減少感官誤差，評價標準見表2。

表2 感官品質評價標準Table 2 Sensory quality evaluation standards

1.2.5.3 蒸煮損失率測定 取攪拌好的魚肉糜制成丸狀，置于蒸煮損失袋中，90 ℃恒溫水浴鍋煮制15 min，取出立即放入干燥器中冷卻到室溫，冷卻至室溫后擦去魚糜凝膠表面水珠進行稱量，平行試驗3 次，取平均值，根據下式計算樣品蒸煮損失率。

式中，W1（g）：樣品蒸煮前質量；W2（g）：樣品蒸煮冷卻后質量。

1.3 數據處理

數據采用Excel2013 進行整理，并采用SPSS22 對單因素實驗中的數據進行方差分析和顯著性分析，數據表示均為平均值±標準差，利用Origin2018 軟件和Design-Expert8.0 進行圖表繪制和響應面優化設計。

2 結果與分析

2.1 食鹽添加量的優化

食鹽是肉制品加工中常見的輔料之一，適宜的食鹽添加可以使肉中的可溶性肌球蛋白有效溶出，并附著在肉表面，改善肉中的水分流失現象。由表3可知，食鹽的添加對香腸的硬度、彈性和咀嚼性均產生影響，隨著食鹽添加量的增加，香腸的硬度和咀嚼性呈現顯著增長（P<0.05）。這可能因為食鹽的添加造成肉糜內外滲透壓差異，導致肉糜內部一部份水分流失，同時鹽含量的增加會導致蛋白質變性，使香腸持水性降低，產品質地變硬，在檢測中產生較高硬度值，并且咀嚼力上升，Brian 等[14]通過研究發現，減少食鹽添加量，法蘭克福香腸的鹽溶性蛋白溶解度出現下降，硬度也出現下降。與對照組（0）相比，添加食鹽的樣品彈性和內聚性也產生了顯著上升（P<0.05），但當食鹽添加量由1.5%～3.5%時，香腸的彈性和內聚性增加并不顯著（P>0.05），這一研究結果與瞿丞等[15]的研究結果一致，其研究發現在低鹽腌制環境下（<6%）雞肉的彈性不發生顯著性變化。

表3 食鹽添加量對低溫魚肉香腸質構特性的影響Table 3 Effect of salt addition on the texture characteristics of fish low-temperature sausage

由圖1可知，隨食鹽添加量的增加，低溫魚肉香腸的感官評分呈先上升后下降的趨勢，說明食鹽的添加可以有效改善香腸的成型率，并且可以掩蓋魚肉自帶的腥味；當食鹽添加量超過2.5%時，感官評分出現下降，這是由于過量的食鹽添加會使產品質地過硬，口感降低，并且食鹽過多添加會使產品過咸，風味降低。低溫魚肉香腸的蒸煮損失率也受到食鹽添加量的影響，食鹽的添加可以顯著降低低溫魚肉香腸的蒸煮損失；但食鹽添加量超過2.5%后，香腸的蒸煮損失率出現突然上升。這是因為食鹽可以增加可溶性蛋白的溶解度，從而提高蛋白的水合作用，使蒸煮損失降低；但在高鹽環境下，可溶性蛋白發生變性，產生“鹽析效應”，使蛋白的水合能力降低[16]，造成蒸煮損失急劇上升現象。Villamonte 等[17]也通過研究發現，在低鹽環境（<4%）下，隨食鹽濃度的增加，腌制豬肉的蒸煮損失率出現降低的現象。因此，綜合以上指標，食鹽添加量為2.5%時，產品效果最好。

圖1 食鹽添加量對低溫魚肉香腸感官評分和蒸煮損失率的影響Fig.1 Effects of salt addition on the sensory scores and cooking loss rate of fish low-temperature sausage

2.2 魚骨粉添加量的優化

由表4可以看出，與對照組相比，魚骨粉添加量為1.5%時，低溫魚肉香腸的硬度和咀嚼性顯著上升（P<0.05），彈性和內聚性的影響不顯著（P>0.05），在魚骨粉添加量為1.5%時，低溫魚肉香腸的硬度和咀嚼性達到最大值，分別為3331.32、2963.54 g，繼續添加魚骨粉，香腸的硬度和咀嚼性顯著下降（P<0.05）。這可能是因為魚骨粉中含有大量的Ca2+，較低含量的Ca2+對魚糜中的轉谷氨酰胺酶起到一定的激活作用，轉谷氨酰胺酶可以提高魚糜中的可溶性肌球蛋白的交聯程度，促進了蛋白質的三維結構暴露內部的一些功能性基團，使相互作用力增大，進而增強香腸的硬度[18]；但Ca2+的含量過高，會在一定程度上抑制轉谷氨酰胺酶的活性，影響交聯程度，使產品硬度下降。這與葉川等[19]的研究結果大致相同。

表4 魚骨粉添加量對低溫魚肉香腸質構特性的影響Table 4 Effect of fish bone meal addition on the texture characteristics of fish low-temperature sausage

由圖2可以看出，魚骨粉對低溫魚肉香腸的感官評分和蒸煮損失率產生一定的影響，隨魚骨粉添加量的增加，香腸的感官評分出現先上升后下降的趨勢，在魚骨粉添加量為1.5%時，香腸的感官評分達到最大值（87.5 分），這是由于適當的魚骨粉添加可以提高低溫魚肉香腸的硬度，從而改善香腸的咀嚼性能，使香腸具有良好的口感，但過量添加魚骨粉會使魚肉香腸表面粗糙，品鑒時會有“沙粒感”，同時魚骨粉過多添加會讓香腸魚腥味過重，導致感官評分降低。香腸的蒸煮損失與其內部結構有關，香腸內部結構越致密、均勻，蒸煮損失率越低，保水性越好，當魚骨粉添加量0～1.5%時，魚肉低溫香腸的蒸煮損失率持續下降，超過1.5%，蒸煮損失率突然升高，這可能由于適量魚骨粉添加可以使魚糜制品的網狀結構更加致密，進而鎖住香腸中更多水分，但過量的魚骨粉會使香腸內Ca2+濃度增加，破壞蛋白質交聯，導致香腸蒸煮損失急劇升高[20]。綜合上述三個指標，在魚骨粉添加量為1.5%時，魚肉低溫香腸具有較好的品質。

圖2 魚骨粉添加量對低溫魚肉香腸感官評分和蒸煮損失率的影響Fig.2 Effects of fish bone meal addition on the sensory scores and the cooking loss rate of fish low-temperature sausage

2.3 玉米淀粉添加量的優化

由表5可知，隨玉米淀粉添加量的增加，低溫魚肉香腸的硬度呈現逐漸上升的趨勢，當玉米淀粉添加量為10%時，低溫魚肉香腸的硬度達到最大值，與前五組有顯著性差異（P<0.05）。適宜的硬度可以使魚肉低溫香腸富有飽滿的外形，同時，產品的硬度決定產品咀嚼性，產品硬度過大會導致咀嚼力增大，影響產品口感。魚肉低溫香腸的彈性隨玉米淀粉添加出現小幅度變化，在玉米淀粉添加量6%時，彈性達到最大值，繼續添加，低溫香腸的彈性出現下降趨勢，這可能是因為淀粉顆粒在蒸煮過程中發生糊化，使低溫香腸組織結構更加致密，從而彈性得到提高，但當玉米淀粉添加過多，會使香腸的硬度上升，內部水分減少，彈性出現下降。此變化趨勢與王晗等[21]研究淀粉對發酵驢肉腸彈性的影響結果一致。

表5 玉米淀粉添加量對低溫魚肉香腸質構特性的影響Table 5 Effects of corn starch addition on texture characteristics of fish low-temperature sausage

由圖3可知，隨著玉米淀粉添加量的增加，低溫魚肉香腸的感官評分逐漸上升，在玉米淀粉添加量為6%時達到峰值，此時制作的香腸結構緊致，切面平整光滑；繼續增大添加量，香腸的感官評分開始出現下降，此時制作的香腸開始出現質地變硬，切面無光澤，口感變差等現象。隨玉米淀粉的添加，低溫香腸的蒸煮損失出現先降低后上升的現象。在低溫香腸蒸煮過程中除魚糜與水作用形成穩定的凝膠網絡，淀粉因高溫發生糊化反應，吸收香腸中的自由水，形成穩定的淀粉凝膠網絡，使得低溫香腸的蒸煮損失率發生下降[22]；繼續添加玉米淀粉，淀粉因不斷受熱糊化、吸水膨脹，導致其破壞魚糜原有的凝膠網絡，造成汁液流失，低溫香腸的蒸煮損失率出現上升。根據不同玉米淀粉的三項指標綜合衡量，選取玉米淀粉最優添加量為6%。

圖3 玉米淀粉添加量對低溫魚肉香腸感官評分和蒸煮損失率的影響Fig.3 Effects of corn starch addition on the sensory scores and the cooking loss rate of fish low-temperature sausage

2.4 響應面優化試驗結果分析

2.4.1 響應面模型建立及回歸方差分析 為確定低溫魚肉香腸的最佳配方，以單因素實驗結果為基礎，采用響應面法對低溫魚肉香腸中食鹽添加量（A）、魚骨粉添加量（B）、玉米淀粉添加量（C）進行三因素三水平試驗設計，以感官評分、蒸煮損失率為響應值，結果如表6所示。試驗結果運用Design-Expert 對各個因素進行二次多元回歸擬合，得到低溫魚肉香腸感官評分和蒸煮損失率二次回歸方程：

表6 Box-Behnken 響應面試驗設計與結果Table 6 Box-Behnken response surface test design and results

低溫魚肉香腸感官評分回歸方程：

Y1=88.97?0.68A?0.60B?0.33C?0.13AB+0.49AC?0.30BC?7.69A2?3.08B2?3.99C2

低溫魚肉香腸蒸煮損失率回歸方程：

Y2=3.48+0.020A+0.061B+0.061C+0.000AB?0.020AC?0.0025BC+0.65A2+0.21B2+0.27C2

由表7方差分析可以看出，以感官評分為響應值時，模型P<0.0001，表明此預測模型極顯著，失擬項不顯著（P=0.2172）；R2=0.9943，R2Adj=0.9871，表明此模型可以很好地反映感官評分與食鹽、魚骨粉和玉米淀粉各因素之間的關系。一次項A 和B 對低溫魚肉香腸的感官評分影響顯著（P<0.05），二次項A2、B2和C2對低溫魚肉香腸感官評分影響極顯著（P<0.01），其余各項均不顯著。根據F值可知，各因素對香腸感官評分影響強弱順序為：A（食鹽添加量）>B（魚骨粉添加量）>C（玉米淀粉添加量）。

表7 感官評分回歸模型方差分析Table 7 Analysis of variance of sensory score regression model

由表8可知，以蒸煮損失率為響應值，模型P<0.0001 極顯著，失擬項=0.0886>0.05 不顯著，擬合度R2=0.9807，R2Adj=0.9558，表明此模型可以很好的描述試驗真實情況。一次項中B、C 顯著（P<0.05），二次項A2、B2和C2均極顯著（P<0.01），通過F值可以判斷出，各因素對魚肉低溫香腸蒸煮損失率的影響大小順序為：C>B>A。

表8 蒸煮損失率回歸模型方差分析Table 8 Analysis of variance of the regression model of the cooking loss rate

2.4.2 響應面因素交互作用分析 為更直觀地了解各因素交互情況下對各指標的影響情況，根據回歸模型方差分析所得數據得出相應的響應面交互圖，探究三因素對低溫魚肉香腸感官評分、蒸煮損失率的交互影響，同時，等高線圖可以很直觀地反映兩因素間交互作用對響應值影響的顯著程度，等高線稀疏呈圓形表示兩因素的交互作用對響應值的影響不具有顯著性，等高線緊密且呈橢圓形表示具兩因素的交互作用對響應值的影響顯著。

由圖4～圖63D 響應曲面可以看出，在設定的自變量范圍內存在響應曲面最高點，說明所選自變量范圍符合要求；食鹽添加量隨著玉米淀粉添加量的變化影響最顯著，因從圖5可以看出曲線較陡，食鹽與魚骨粉添加量影響次之，玉米淀粉與魚骨粉添加量變化最為平緩，說明食鹽添加量對低溫魚肉香腸的感官品質影響最大，這與感官評分回歸方程方差分析結果一致；從等高線圖來看，圖4、圖5均為近圓形，圖6橢圓效果相對較明顯，因此三因素兩兩交互對香腸感官影響均不顯著，這也與表7的結果相吻合，符合所需產品優化配方。

圖4 食鹽與魚骨粉添加量的交互作用對低溫魚肉香腸感官評分的影響Fig.4 Effect of the interaction of salt and fish bone meal on the sensory scores of fish low-temperature sausage

圖5 食鹽與玉米淀粉添加量的交互作用對低溫魚肉香腸感官評分的影響Fig.5 Effect of the interaction of salt and cornstarch on the sensory scores of fish low-temperature sausage

圖6 魚骨粉與玉米淀粉添加量的交互作用對低溫魚肉香腸感官評分的影響Fig.6 Effect of the interaction of fish bone meal and corn starch addition on the sensory scores of fish low-temperature sausage

2.4.3 產品最優配方與驗證試驗 采用Design Expert 8.0 進行試驗結果分析，由模型預測得出最優配方方案：食鹽添加量2.49%、魚骨粉添加量1.46%、玉米淀粉添加量5.89%，對應的感官評分為89.00 分、蒸煮損失率為3.47%、理論取值R 值0.947，考慮生產便利性調整上述各因素添加量為：食鹽添加量2.5%、魚骨粉添加量1.5%、玉米淀粉添加量6%，平行進行試驗3 次，取平均值，得到低溫魚肉香腸感官評分為（88.55±0.57）分，蒸煮損失率為3.51%±0.01%，與預測值相近，制得產品切面光滑、無氣泡，魚肉香氣濃郁，無不良風味，由此可以判斷，此響應面試驗設計的配方方案可行性極高，對實踐具有一定指導意義。

由圖7～圖9中3D 曲面圖可以看出，各因素交互作用在設定參數范圍內均出現最小點，表明參數范圍合理；等高線圖中，圖7～圖9均近橢圓形，說明三因素交互作用對低溫魚肉香腸的蒸煮損失率存在影響，但并不顯著（P>0.05），綜合回歸方程方差分析結果可知，食鹽、魚骨粉和玉米淀粉三因素添加量兩兩交互作用對低溫魚肉香腸的蒸煮損失率均不顯著。

圖7 食鹽與魚骨粉添加量的交互作用對低溫魚肉香腸蒸煮損失率的影響Fig.7 Effect of the interaction of salt and fish bone meal addition on the cooking loss rate of low-temperature fish sausage

圖8 食鹽與玉米淀粉添加量的交互作用對低溫魚肉香腸蒸煮損失率的影響Fig.8 Effect of the interaction of salt and corn starch addition on the cooking loss rate of low-temperature fish sausage

圖9 魚骨粉與玉米淀粉添加量的交互作用對低溫魚肉香腸蒸煮損失率的影響Fig.9 Effect of the interaction of the addition of fish bone meal and corn starch on the cooking loss rate of low-temperature fish sausage

3 結論

在單因素基礎上，以食鹽添加量、魚骨粉添加量和玉米淀粉添加量為自變量因素，通過響應面法優化并確定低溫魚肉香腸最優配方。研究表明食鹽添加量對低溫魚肉香腸的感官品質影響最大，玉米淀粉添加量對低溫魚肉香腸的蒸煮損失率影響最大。最終，綜合所有因素經過三次平行試驗驗證，確定低溫魚肉香腸中食鹽2.5%、魚骨粉1.5%和玉米淀粉6%，以此條件制作產品的感官評分為88.55 分，蒸煮損失率為3.51%，與模型預測值吻合率分別達到99.49%和98.86%，方案具有一定可行性，為進一步實現低溫魚肉香腸工業化生產提供了一定的數據支撐，為后期試驗奠定基礎。