超聲輔助硫酸水解法制備銀杏果殼納米纖維素及其特性表征

薛 剛，何 易，李小白，章 智，張有做，許光治,*

（1.浙江農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)與食品科學學院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術研究重點實驗室，浙江杭州 311300；2.山西省大同市綜合檢驗檢測中心，山西大同 037000）

納米纖維素是纖維素通過酸水解或機械處理等去除無規(guī)區(qū)而獲得的直徑1～100 nm 的超微細纖維素[1]。NCC 具有比表面積大、生物相容性好、高結晶度、高楊氏模量[2?4]等特性，在醫(yī)藥[5?6]、復合材料[7]、食品工業(yè)[8]等鄰域均有廣闊的潛在應用前景。農(nóng)業(yè)廢物中含有大量的纖維素，來源廣泛且經(jīng)濟是制備NCC 的重要原料。但纖維素來源和制備工藝的差異對NCC 產(chǎn)率、形態(tài)尺寸、結晶度等有一定影響，可改變其作為增強材料的性能和應用范圍[9]。因此，有關不同原料和制備工藝對NCC 結構影響的研究引起越來越多的關注[10?14]。

我國是銀杏的發(fā)源地，現(xiàn)有廣東南雄、江蘇泰興、江蘇邳州、山東郯城、湖北安陸、浙江長興六大銀杏產(chǎn)業(yè)基地。2015年，我國銀杏果產(chǎn)量1.8 億噸，約占世界總量的70%[15]。果殼作為農(nóng)業(yè)廢棄物通常直接燃燒或掩埋在土壤中，不僅破壞環(huán)境而且浪費資源[16]。銀杏果殼約含44.34%纖維素，是良好的纖維素源，可用于NCC 的制備[15]。近些年來，為了進一步提高NCC 的產(chǎn)率，有關更加綠色高效制備前處理的研究越來越多，包括有機酸水解前處理、低共熔溶劑前處理、離子液體前處理和溶劑輔助前處理等，更多的是將幾種方法結合。最近，Yang 等[15,17]以銀杏果殼為原料，通過酸水解結合高壓均質(zhì)法處理制得不同長度的NCC，并比較不同長度的NCC 對Pickering乳液穩(wěn)定性的影響，結果表明，小尺寸和高疏水性的NCC 具有更低的界面張力，NCC 可充當Pickering穩(wěn)定劑并形成界面膜。而以銀杏果殼為原料制備NCC 的條件優(yōu)化及表征鮮有報道。

本實驗以銀杏果殼為原料，采用超聲輔助硫酸水解法制備銀杏果殼NCC，以單因素為基礎進行正交試驗來優(yōu)化其制備條件，并比較超聲輔助和常規(guī)硫酸水解處理對銀杏果殼NCC 形態(tài)、粒徑、晶體結構、紅外光譜特性、熱穩(wěn)定性等特性的影響，以期高效地獲得銀杏果殼NCC，為銀杏果殼廢棄物的再利用和NCC 的制備研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏果 2019年9月采自浙江農(nóng)林大學東湖校區(qū)（剝殼，脫去內(nèi)皮，洗凈，果殼60 ℃烘干，粉碎后過80 目篩，正己烷脫脂，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫粊喡人徕c、硫酸、氫氧化鈉、冰醋酸、乙二胺四乙酸二鈉、硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉、乙二醇乙醚、無水磷酸氫二鈉、十六烷三甲基溴化銨、十氫化萘、無水亞硫酸鈉、丙酮等其他試劑 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TGL-20B-C 高速離心機 上海安亭科學儀器廠；ZetaPALS 電位及粒徑分析儀 美國Brookhaven 公司；Quanta 650 掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；JEM-1400EX 透射電子顯微鏡 日本JEOL 公司；XRD 6000 X-射線衍射、IR Prestige-21 傅立葉變換紅外光譜儀 日本島津有限公司；STA 409C 綜合熱分析儀 德國Netzsch 公司；Freezone 冷凍速干機美國Labconco 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀杏果殼纖維素提取 銀杏果殼木質(zhì)素和半纖維素的去除按照參考文獻[10]進行。木質(zhì)素去除：取銀杏果殼粉，按料液比1:10 加1.5%（w/v）的亞氯酸鈉溶液（pH=3～4），70 ℃水浴中持續(xù)攪拌2 h，抽濾，水洗濾渣至中性，重復漂白過程5～6 次，直到獲得白色產(chǎn)物。半纖維素去除：去除木質(zhì)素的銀杏殼用1 mol/L NaOH 溶液處理2 h（65 ℃），抽濾去除溶解的半纖維素，水洗濾渣至中性，得到化學純化的銀杏果殼纖維素（chemically purified cellulose from ginkgo nut shell,CPC-GNS），60 ℃干燥，粉碎備用。

1.2.2 主要化學成分測定 銀杏果殼和銀杏果殼纖維素中纖維素、木質(zhì)素和半纖維素含量的采用范氏（Van Soest）法[18]測定。

1.2.3 銀杏果殼納米纖維素的制備 稱取上述銀杏果殼纖維素，按1:20 的料液比分散于指定濃度（按質(zhì)量分數(shù)計）的硫酸水溶液中，室溫潤脹10 min。將混合液置于恒定功率（120 W）的超聲波清洗器中，不斷攪拌，恒定溫度下反應一定時間后，加入約20 倍的4 ℃預冷去離子水終止反應。對反應產(chǎn)物進行高速離心（10000 r/min，10 min），棄取上清液，沉淀物用去離子水洗滌，重復3～4 次離心（溶液呈弱酸性）至上層液體為乳白色的納米纖維素懸浮液，將此懸浮液裝入透析袋中，用去離子水透析至pH 呈中性。透析好的NCC 懸浮液經(jīng)真空冷凍干燥得到銀杏果殼納米纖維素粉末。

1.2.4 NCC-GNS 得率的測定 取20 mL 透析至中性的NCC-GNS 懸浮液于稱量瓶中，105 ℃烘干至恒重，取出至干燥器內(nèi)冷卻30 min，稱重，按下面的公式計算得率。

式中：Y—納米纖維素得率，%；m1—干燥后稱量瓶和樣品的總質(zhì)量，g；m2—稱量瓶的質(zhì)量，g；m3—纖維素原料的質(zhì)量，g；V1—納米纖維素懸浮液的總體積，mL；V2—量取的納米纖維素懸浮液的體積，mL。

1.2.5 單因素實驗 取一定量的銀杏果殼纖維素，按方法1.2.3 制備NCC。以NCC 得率為指標，選取硫酸質(zhì)量分數(shù)（44%、46%、48%、50%、52%）、反應溫度（50、55、60、65、70 ℃）、反應時間（15、20、25、30、35 min）作為單因素條件進行實驗分析，選取某一因素進行實驗時，其他因素均選取固定水平（硫酸質(zhì)量分數(shù)48%、反應溫度60 ℃、反應時間25 min）對應的參數(shù)。

1.2.6 正交試驗 為了優(yōu)化實驗參數(shù)，根據(jù)單因素實驗的結果，以NCC 得率為考核目標，采用正交試驗來研究硫酸質(zhì)量分數(shù)、反應溫度和反應時間對NCC 得率的影響，以確定最佳的制備條件，正交試驗設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.7 NCC 形貌表征

1.2.7.1 SEM 分析 用掃描電子顯微鏡進行形貌觀察。取干燥備用NCC，通過導電膠沾在干凈的樣品臺上，并進行噴金處理，設置電壓為1 kV。

1.2.7.2 TEM 分析 用透射電子顯微鏡觀察NCC的形態(tài)和粒徑分布情況。將鍍碳支持膜銅網(wǎng)放置封口膜上，取一滴NCC 懸浮液（1wt%）到支持膜表面，停留10 min，去除多余溶液。再將干燥后的支持膜放置封口膜上，加1 滴醋酸雙氧鈾染液，染色約90 s，吸去多余染液，干燥3 h 后進行觀察。

1.2.7.3 粒徑分析 從透射電鏡照片中選取100 個單獨NCC，利用Gatan Digital Micrograph image J軟件進行標記，用圖片尺寸測量NCC 的長度和直徑，通過Origin 軟件來完成數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析制圖。

1.2.7.4 Zeta 電位和DLS 測定 用ZetaPALS 測定NCC 懸浮液的Zeta 電位和顆粒尺寸，測試條件為25 ℃，測試3 次，取平均值。

1.2.7.5 XRD 測定 用X-射線衍射儀進行測定，Cu靶，電壓40 kV，電流30 mA，掃描范圍為5°～40°，連續(xù)掃描，掃描速度2°/min，間距0.02°。用分峰法將無定型區(qū)散射與各晶面的衍射峰分開，根據(jù)各峰的面積計算結晶度Xc[19]。

1.2.7.6 FT-IR 測定 用傅立葉變換紅外光譜儀（KBr 壓片法）記錄樣品的紅外光譜，掃描范圍400～4000 cm?1。

1.2.7.7 TGA 測定 用綜合熱分析儀分析樣品的熱力特性，溫度范圍為30～600℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗采用 SPSS 25.0、Jade 5、Origin 2017 等軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 銀杏果殼及銀杏果殼纖維素主要化學成分分析

本實驗使用的銀杏果殼主要化學成分為：木質(zhì)素（52.12±0.89）wt%、纖維素（36.26±1.03）wt%、半纖維素（4.52±0.91）wt%（見表2），主要化學成分與Yang 等[15]報道的數(shù)據(jù)基本一致。通過亞氯酸鈉和NaOH 處理去除木質(zhì)素和半纖維素，得到銀杏果殼纖維素，其纖維素含量提高至（83.22±1.18）wt%，木質(zhì)素和半纖維素的含量分別降至（5.05±0.81）wt%和（0.53±0.17）wt%，表明化學純化得到的銀杏果殼纖維素可用于NCC 的制備。

表2 銀杏果殼和銀杏果殼纖維素化學成分Table 2 Chemical composition of GNS and CPC-GNS

2.2 單因素和正交實驗分析

2.2.1 硫酸質(zhì)量分數(shù)對NCC-GNS 得率的影響 由圖1可知，隨著硫酸質(zhì)量分數(shù)的不斷提高，NCCGNS 的得率呈先增大后減小的趨勢，當硫酸的質(zhì)量分數(shù)為48%時NCC-GNS 的得率最高，為37.01%。硫酸濃度是NCC-GNS 制備的關鍵因素，不同來源的纖維素結構存在差異，制備NCC-GNS 所需硫酸的濃度也不盡相同。硫酸濃度較低時體系中的氫離子濃度較小水解程度較低，難將纖維水解到納米級別，NCC-GNS 得率低；隨著硫酸濃度的升高，更多纖維素分子之間的糖苷鍵發(fā)生斷裂，產(chǎn)生更多的納米級纖維素，NCC-GNS 得率增加。但過高的硫酸濃度又會導致纖維素的進一步水解，降解為葡萄糖，使得NCC-GNS 得率降低[13]。

圖1 硫酸質(zhì)量分數(shù)對NCC-GNS 得率的影響Fig.1 Effect of sulfuric acid mass fraction on NCC-GNS yield

2.2.2 反應溫度對NCC-GNS 得率的影響 由圖2可知，隨著反應溫度增加，NCC-GNS 的得率先增大后減小，當反應溫度為60 ℃時NCC-GNS 的得率最高，為37.06%。這是因為反應溫度會影響硫酸水解纖維素的效率，溫度較低時酸水解反應不充分，NCCGNS 得率較低，隨著反應溫度的升高，促進了更多纖維素分子鏈上糖苷鍵的斷裂，纖維素被水解細化到納米級別。但過高的反應溫度也降低NCC-GNS 得率，甚至還會導致纖維素的炭化[20]。

圖2 反應溫度對NCC-GNS 得率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on NCC-GNS yield

2.2.3 反應時間對NCC-GNS 得率的影響 由圖3可知，隨著反應時間的增加，NCC-GNS 的得率先增大后減小，當反應時間為25 min 時NCC-GNS 的得率最高，為36.58%。這是因為酸解時間較短時纖維素與硫酸接觸不充分，反應不完全，隨著反應時間的增加，水解反應進行程度不斷增大。但是過長的反應時間，纖維素在硫酸溶液中發(fā)生均相水解反應，纖維素進一步降解為葡萄糖，使得NCC-GNS 得率降低。

圖3 反應時間對NCC-GNS 得率的影響Fig.3 Effect of reaction time on NCC-GNS yield

2.2.4 正交試驗結果 根據(jù)單因素實驗的結果，以NCC-GNS 得率為指標，采用正交試驗來研究硫酸質(zhì)量分數(shù)、反應溫度和反應時間對NCC-GNS 得率的影響，以確定最佳的制備條件。正交試驗結果及直觀分析見表3。

表3 正交試驗結果及直觀分析Table 3 Orthogonal test results and visual analysis

由表3極差分析結果可以得出，A、B、C 三個因素影響得率的主次順序為硫酸質(zhì)量分數(shù)>反應溫度>反應時間，最佳條件組合為 A2B2C2，即硫酸質(zhì)量分數(shù)48%、反應溫度60 ℃、反應時間25 min。進一步檢驗3 個因素的顯著性程度，對實驗結果進行方差分析，分析結果見表4。

表4 方差分析表Table 4 Variance analysis table

由表4可知因素A、B、C 對實驗結果都有顯著的影響。實驗指標是NCC-GNS 的得率，在不考慮交互作用的情況下，最優(yōu)方案應取各因素最大K 值所對應的水平，為A2B2C2，即硫酸質(zhì)量分數(shù)48%、反應溫度60 ℃、反應時間25 min。與單因素實驗結果相符。在最優(yōu)條件下進行驗證實驗，得到NCCGNS 的得率為36.89%±1.2%。

本實驗采用超聲輔助硫酸水解法制備NCCGNS，主要利用超聲波的空化作用提高反應效率，較高于常規(guī)硫酸水解（未加超聲輔助，硫酸質(zhì)量分數(shù)48%、反應溫度為60 ℃、反應時間為25 min，制備NCC-GNS 的得率30.16%±0.91%）。

2.3 NCC-GNS 表征

為分析NCC-GNS 的結構特征，在最優(yōu)制備條件下，對超聲輔助硫酸水解法制備的NCC-GNS和常規(guī)硫酸水解法制備的NCC就形態(tài)、粒徑、Zeta電位、結晶度、紅外光譜及熱力學特性進行表征。

2.3.1 形貌觀察 NCC-GNS 和NCC 的掃描電鏡如圖4所示，NCC-GNS 呈棒狀結構，納米棒緊密的纏結在一起，形成了類似“薄膜”一樣的結構。

圖4 NCC-GNS 和NCC 的掃描電鏡Fig.4 SEM of NCC-GNS and NCC

NCC-GNS 和NCC 的透射電鏡結果如圖5所示，與掃描電鏡結果一致，NCC-GNS 呈棒狀結構，棒狀細長，納米棒之間有粘連和堆疊的現(xiàn)象。但NCCGNS 較NCC 分布均勻，這可能是因為超聲輔助處理促進了納米棒的分布。但NCC 粒徑很小，比表面積巨大，使得納米棒之間受范德華力的影響較為明顯，導致團聚和堆疊現(xiàn)象的發(fā)生[21]。

圖5 NCC-GNS 和NCC 的透射電鏡Fig.5 TEM of NCC-GNS and NCC

2.3.2 粒徑分析 根據(jù)透射電鏡的結果，進一步用軟件Gatan Digital Micrograph image J 分析NCC-GNS的長度和直徑分布。由圖6可知，NCC-GNS-Y 長度集中在80～180 nm，直徑集中在3.5～5.5 nm，而NCCGNS-N 長度和直徑范圍更寬，長度在40～220 nm，直徑在3.5～7.5 nm。說明超聲輔助處理制備的NCCGNS 尺寸更加均勻，與透射電鏡觀察的結果相符。NCC-GNS-Y 長徑比為27±3，大于以開心果殼和菠蘿葉等廢棄物為來源制備的NCC[11,22]。高長徑比會增加界面面積，從而提高復合材料的機械性能[12]。NCC-GNS-Y 直徑小、長徑比較高，在復合材料中有較好的應用前景。

圖6 NCC-GNS-Y 和NCC-GNS-N 長度和直徑分布圖Fig.6 Distribution of length and diameter of NCC-GNS and NCC

2.3.3 Zeta 電位和DLS 分析 超聲輔助和常規(guī)硫酸水解制備NCC-GNS 懸浮液的Zeta 電位和DLS 分析如表5所示。NCC-GNS 和NCC 懸浮液Zeta 電位絕對值均大于30.00 mV，表明體系比較穩(wěn)定；NCC-GNS 經(jīng)DLS 測得長度尺寸略小于NCC；經(jīng)DLS 測得兩種方法制備的NCC-GNS 長度尺寸略小于TEM 的觀察結果，其懸浮液的Zeta 電位和粒徑大小無明顯差異。

表5 Zeta 電位和DLSTable 5 Zeta potential and DLS

2.3.4 X-射線衍射分析 銀杏果殼、銀杏果殼纖維素、NCC-GNS 和NCC 的X-射線衍射如圖7所示，樣品均都在2θ=14.7°、16.4°、22.4°處出現(xiàn)了較強的衍射峰，分別對應的是1-10、110 和200 晶面，與天然纖維素Ⅰβ 的特征衍射峰一致[23]，表明酸水解和超聲處理均未改變主晶體結構。但NCC-GNS 和NCC 出現(xiàn)了兩個小峰（圖7，虛線圓圈標記為1 和2），可能是由于少量的纖維素II 存在造成的。樣品結晶度從原料GNS 的52%分別提高至NCC 的75%和NCC-GNS 的88%。與陸紅佳等[24]超聲波輔助酸法制備納米薯渣纖維素的結果相似，超聲處理提高了NCC 的結晶度。說明超聲處理通過空化作用促進了NCC 的水解分離，對NCC-GNS 的結晶度產(chǎn)生積極的影響。

圖7 銀杏果殼、銀杏果殼纖維素和NCC-GNS XRD 圖Fig.7 X-ray diffraction of ginkgo biloba shell,ginkgo biloba shell cellulose and NCC-GNS

2.3.5 紅外光譜分析 銀杏果殼、銀杏果殼纖維素、NCC和NCC-GNS 的FT-IR 光譜如圖8所示。不同樣品的特征峰沒有發(fā)生明顯變化，說明超聲輔助硫酸水解制備NCC 過程中未破壞和改變纖維素分子的主要化學結構。純化和提取纖維素的過程，1730、1510 和1270 cm?1處的光譜峰逐漸消失，表明大部分木質(zhì)素和其他多糖已被去除[10]，這些譜峰與酯基（C=O）的特征拉伸頻率和木質(zhì)素、半纖維素以及其他組分中的芳環(huán)拉伸振動有關[2]。

圖8 銀杏果殼、銀杏果殼纖維素和NCC-GNS 紅外光譜圖Fig.8 FT-IR spectrum of ginkgo biloba shell,ginkgo biloba shell cellulose and NCC-GNS

由圖7可知，兩種方法制備的NCC-GNS 與NCC均存在纖維素Ⅰ的特征吸收譜帶：1435、1061 和895 cm?1處的吸收峰分別對應-CH2-（C6）-彎曲、吡喃糖環(huán)C-O 拉伸和β-糖苷鍵的彎曲振動吸收峰。在1636、3420 和2900 cm-1處的吸收峰分別對應吸附水中H-O-H 的彎曲振動、纖維素分子中羥基的OH 的伸縮振動和亞甲基的C-H 對稱伸縮振動吸收峰[25]。NCC-GNS 和NCC 在1200 cm?1出現(xiàn)的小峰是硫酸基團S=O 振動的結果，酸水解后NCC-GNS表面引入的帶負電荷的硫酸基團[26]。

2.3.6 熱重分析 銀杏果殼、銀杏果殼纖維素、NCC 和NCC-GNS 熱重分析如表6和圖9所示。根據(jù)以前的研究[27]，第一階段出現(xiàn)的熱失重現(xiàn)象，溫度低于100℃，主要與吸收水的蒸發(fā)有關；第二階段，溫度大于170℃時開始纖維素熱分解過程，包括解聚、脫水和糖苷單元的分解；第三階段熱分解過程溫度大于270℃，主要是纖維素分解的殘余燒焦物。由DTG曲線可以看出，NCC-GNS、NCC 和銀杏果殼纖維素最大失重速率時的溫度分別為254、309、331 ℃，NCC-GNS 最大失重速率時的溫度明顯小于NCC 和銀杏果殼纖維素。原因是經(jīng)硫酸水解制備的NCCGNS 表面接枝了帶負電荷的磺酸基，超聲輔助使得NCC-GNS 的表面熱暴露增大從而接入了更多的磺酸基團[28]，從而降低了NCC-GNS 的熱解溫度。由于磺酸基團的阻燃行為和NCC-GNS 的高結晶度[29]，在600 ℃時，NCC-GNS 的殘余率為24.38%，高于銀杏果殼纖維素。

表6 綜合熱分析結果Table 6 Result of comprehensive thermal analysis

圖9 銀杏果殼、銀杏果殼纖維素和NCC-GNS TG、DTG 圖Fig.9 TG and DTG curves of ginkgo biloba shell,ginkgo biloba shell cellulose and NCC-GNS

兩種方法制備的銀杏果殼納米纖維素，它們的TG 和DTG曲線變化趨勢極為相似，制備的銀杏果殼納米纖維素具有良好的熱穩(wěn)定性，在耐熱性復合材料中應用表現(xiàn)出一定潛能[30]。

3 結論

本實驗探究了超聲輔助硫酸水解法對制備NCC-GNS 的影響，并通過單因素實驗和正交試驗獲得最優(yōu)制備條件。超聲輔助和常規(guī)硫酸水解法制備的銀杏果殼納米纖維素均為長棒型，尺寸無明顯差異，其中超聲輔助制備的銀杏果殼納米纖維素長度和直徑范圍相對集中。兩種方法制備的銀杏果殼納米纖維素均具有較低的Zeta 電位。超聲輔助硫酸水解制備的銀杏果殼納米纖維素結晶度為88%，高于常規(guī)硫酸水解的75%，仍屬纖維素Ⅰβ型。此制備過程中未發(fā)生化學結構的破壞和改變，纖維素分子的化學結構保持不變。超聲輔助硫酸水解制備的NCCGNS 在600 ℃時仍有較高的殘余率（24.38%），有良好的熱穩(wěn)定性。采用超聲輔助硫酸水解法制備出的高得率、高長徑比、高結晶度、良好熱穩(wěn)定性的納米纖維素有望在食品包裝、復合材料等領域中得到進一步應用。