通過式固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中多種受體激動劑藥物殘留

李艷明，王 坤，朱富強，高會蘭

（1.濱州市檢驗檢測中心，山東濱州 256600；2.濱州市職業學院，山東濱州 256603）

受體激動劑目前主要是指α2-受體激動劑和β2-受體激動劑，俗稱“瘦肉精”。α2-受體激動劑中的可樂定（Clonidine）是一種腎上腺素能，位于中樞神經系統，其在動物上有促進生長的作用。王雷杰等[1]在飼料中添加可樂定發現，豬的瘦肉率明顯提高，眼肌面積增加，脂肪比率降低，背膘厚度減少。α2-受體激動劑除可樂定還包括替扎尼定、安普樂定、溴莫尼定、賽拉嗪等物質[2]。賽庚啶（Cyproheptadine）屬H1型抗過敏性藥物，可以用于治療蕁麻疹等疾病，并有抗5-羥色胺及抗膽堿的作用，可以使機體中樞神經興奮，降低飽腹感，增加食量和體重[2]。β2-受體激動劑是一種腎上腺素的受體激動劑，其主要用途是防治支氣管哮喘。牲畜體使用后，能夠改變其體內代謝的方式，促進肌肉生長，并且可以快速轉化脂肪和分解脂肪，促進合成骨骼肌蛋白，最終達到提高牲畜瘦肉率的目的[3?6]。常見的β2-受體激動劑有鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等[7?9]。這些種類的“瘦肉精”，進入機體，可能會導致其出現頭暈心悸等中毒反應，甚至死亡[10?12]，目前已經禁止在養殖的食用動物中使用受體激動劑[13]。

α2-受體激動劑因其在動物養殖方面的非法添加可能造成安全隱患，我國農業部的第1519 號公告[14]中明確規定，可樂定與賽庚啶禁止在飼料和動物飲用水中使用。我國農業部公告176 號[15]、193 號[16]、1519 號[14]，對禁止在食用動物飼料添加相關的β2-受體激動劑也進行了說明。目前對于α2-受體激動劑在動物組織中的研究較少，Fan 等[17]利用QuEChERS的方法，超高效液相色譜串聯質譜的技術，檢測可樂定與賽庚啶在豬肉、豬肝和豬腎的殘留。β2-受體激動劑研究的比較多也比較成熟，檢測技術也得到了飛快發展[18?20]，包括氣相色譜串聯質譜法[21]，液相色譜串聯質譜法[22?24]，其中液相色譜串聯質譜法應用的較多。國家標準GB 31660.6-2019[25]與GB/T 22286-2008[26]分別規定了α2-受體激動劑和β2-受體激動劑的檢測方法。離子交換固相萃取小柱（SPE）是目前采用的凈化方式，α2-受體激動劑和β2-受體激動劑是不同的檢驗方法，但均采用SPE 進行凈化。SPE 需要活化，上樣，淋洗，洗脫4 個步驟，才能達到凈化的目的，方法費時，操作繁瑣，試劑耗材大量消耗[27?28]。為濃縮樣品及避免溶劑效應，將SPE 凈化后的樣品旋蒸或者氮吹，一批樣品旋蒸或者氮吹都會消耗近1 h的時間，并且氮吹時可能會帶來交叉污染等各種不確定因素，前處理需要花費大量的時間。

通過式固相萃取小柱，無需活化，直接上樣并接收，即可達到去除基質的目的，凈化效果顯著。目前沒有將通過式固相萃取小柱運用到多種類受體激動劑的同時檢測當中的相關報道。本文采用通過式固相萃取小柱，對豬肉中的α2型、β2型、H1型等11 種受體激動劑進行同時檢測，該方法可以運用到豬肉受體激動劑的風險監測樣品及突發事件的及時處置當中。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉 在本市隨機選取小型市場與市集10 個，每個市場選取3 個豬肉攤位，共計30 份樣品；乙腈、甲醇 色譜純，美國TEDIA 公司；甲酸 色譜純，美國ACS 恩科化學；乙酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；乙酸銨 色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶>100.000 units/mL 上海安譜實驗科技股份有限公司；乙酸銨緩沖溶液0.2 mol/L：稱取15.4 g 乙酸銨，超純水溶解之后，定容至1 L，用適量乙酸調節pH 至5.2；85%乙腈水溶液（含0.2%甲酸）：量取850 mL 乙腈，加入2 mL 甲酸，超純水定容至1 L；11 種受體激動劑標準品：替扎尼定（99.9%，CAS 號64461-82-1）、賽拉嗪（99.6%，CAS 號23076-35-9）、溴莫尼定（99.0%，CAS 號59803-98-4）、安普樂定（97.0%，CAS 號73218-79-8）、可樂定（98.3%，CAS號4205-91-8） Stanford Chemicals 公司；鹽酸賽庚啶（液體，濃度100 μg/mL，CAS 號969-33-5） First Standard 公司；鹽酸克倫特羅（99.3%，CAS 號21898-19-1）、沙丁胺醇半硫酸鹽（99.4%，CAS 號23031-32-5）、萊克多巴胺鹽酸鹽（95.0%，CAS 號90274-24-1）、硫酸特布他林（99.6%，CAS 號23031-32-5）

Dr.Ehrenstorfer 公司；西馬特羅（液體，濃度100 μg/mL，CAS 號54239-37-1） 農業部環境保護科研監測所；Wates Oasis PRIME HLB 固相萃取小柱 6cc 200 mg，沃特世科技公司；Bond Elut EMRLipid 分散SPE1g/管、EMR-Lipid Bond Elut Polish反萃管2 g/管，安捷倫科技有限公司。

Agilent1290II-6470QQQ 超高效液相色譜串聯質譜儀（UPLC-MS/MS） 配有ESI 電噴霧離子源并裝有MassHunter B.08.00 數據處理軟件，美國Agilent 公司；ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜儀、XevoTQ-XS 三重四極桿質譜儀 美國Waters 公司；ME204T 電子天平 精度0.0001 g，上海梅特勒—托利多儀器有限公司；MILLI-Q ADWANTAGE A10 超純水機 美國密理博公司；SB25-12 DTD 超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SGLMultis-100 多管渦旋混合儀 島津（上海）實驗器材有限公司；3k15 高速冷凍離心機 美國Sigma 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 準確稱取標準品替扎尼定、賽拉嗪、溴莫尼定、安普樂定、可樂定、鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇半硫酸鹽、萊克多巴胺鹽酸鹽、硫酸特布他林各10 mg 于10 mL 棕色容量瓶當中，用甲醇溶解，定容后，配制成濃度為1 mg/mL 的標準儲備液，準確量取液體標準品鹽酸賽庚啶、西馬特羅1 mL 于10 mL 棕色容量瓶當中，用甲醇溶解，定容后，配制成濃度為10 mg/L 的標準儲備液，使用前，用甲醇配制成1 mg/L 的標準物質中間液，根據需要，配制成所需濃度的標準系列工作溶液。

1.2.2 超高效液相色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18RRHD 1.8 μm，2.1 mm×50 mm；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流動相；A 為0.1%甲酸水溶液，B 為乙腈，梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Condition of gradient elution

1.2.3 質譜條件 電離模式：電噴霧正離子模式（ESI+）；多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）質譜分析方法；毛細管電壓3500 V；噴嘴電壓500 V；干燥氣溫度250 ℃；干燥氣流量8 L/min；霧化氣壓力45 psi；鞘氣溫度300 ℃；鞘氣流量11 L/min；11 種受體激動劑的質譜參數見表2。

表2 11 種物質質譜參數Table 2 Chromatography-mass spectrometry parameters of eleven substances

1.2.4 樣品前處理 豬肉用粉碎機充分混勻粉碎，稱取2.0000 g 左右的樣品于50 mL 離心管中，加入2 mL 0.2 mol/L 乙酸銨緩沖溶液（pH=5.2），40 μL 的β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，于37 ℃下水浴振蕩16 h，充分酶解，加入8 mL 85%乙腈水溶液（含0.2%甲酸），渦旋5 min，于10000 r/min 冷凍（?4 ℃）離心5 min，取上清液過Waters Oasis PRiME HLB 小柱，棄去前0.6 mL 初濾液，收集流出液0.5 mL，加入初始流動相0.5 mL，渦旋混勻，過0.22 μm 有機濾膜，UPLCMS/MS 進樣檢測。

1.3 數據處理

UPLC-MS/MS 配有MassHunter B.08.00 數據處理軟件，譜圖為Origin61 做圖軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 色譜質譜參數的優化

為了獲得良好的分離效果，在色譜柱的選擇、流動相的選擇以及梯度洗脫條件進行了優化。采用C18柱可對11 種物質進行很好的分離，并且峰形良好。流動相的選取對于目標化合物的保留時間和色譜峰形狀以及靈敏度也會有很大的影響，根據11 種物質的結構可知，加酸更易使其離子化，因此選擇0.1%（v/v）甲酸水與乙腈作為流動相。更改流動相的配比，使11 種物質達到最佳的分離，同時到達最佳峰面積。梯度洗脫程序見表1。

本實驗分別配制100 ng/mL 的各種化合物標準溶液，選擇ESI+模式，對11 種物質進行優化參數。標準樣品與流動性混合后，不經過色譜柱直接連接質譜的方式，利用MRM 采集模式，優化出母離子、子離子、碰撞電壓、碰撞能量等參數，優化結果見表2。11 種物質的標準溶液總離子流圖和MRM 圖提取離子色譜圖見圖1和圖2。

圖1 11 種物質標準溶液的總離子流圖（1.0 μg/L）Fig.1 TIC chromatograms of standard solution of eleven substances (1.0 μg/L)

圖2 11 種物質標準溶液的MRM 圖（0.5 μg/L）Fig.2 MRM chromatograms of standard solution of eleven substances (0.5 μg/L)

2.2 前處理條件的選取

2.2.1 提取溶劑的選擇β2-受體激動劑大多有苯乙胺醇和叔丁基或異丙基連接而成，一般分為苯胺型（克倫特羅、西馬特羅）、苯酚型（沙丁胺醇）、間苯二酚型（菜克多巴胺）。β2-受體激動劑在體內代謝完，會跟羥基結合，進而形成一個葡萄糖醛苷的代謝物，若要檢測，需將其酶解后游離出來[29]。而苯胺型的克倫特羅與蛋白結合率低，因而不需要酶解。而α2型與H1型并沒有這種現象，綜合考慮，仍需對豬肉進行酶解再進行實驗，具體酶解步驟為，在豬肉樣品里面加入40 μL 的β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，在37 ℃下水浴16 h。選擇豬肉樣品4 份，分別編號樣品1、樣品2、樣品3、樣品4，樣品1 與樣品2 按照處理步驟進行，樣品3 與樣品4 不加入β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，其余步驟相同，具體結果見表3。比較4 份樣品可以看出，酶解與否，對于α2型與H1型的回收率并無影響。

表3 酶解對α2 型與H1 型回收率的影響Table 3 Effect of enzymatic hydrolysis on recovery of α2 and H1

在不含待測7 種物質的陰性樣品中加入標準溶液，進行加標回收試驗，提取溶劑分別選用含0.2%（v/v）甲酸的純乙腈、含0.2%（v/v）甲酸的85%乙腈溶液、含0.2%（v/v）甲酸的70%乙腈溶液，具體結果見圖3。結果表明，在純乙腈中，沙丁胺醇與賽庚啶的回收率僅有60%左右，而在70%的乙腈溶液中，萊克多巴胺、克倫特羅、賽庚啶、西馬特羅的回收率均低于60%，原因是純乙腈沒有讓基質分散開，提取效率不高，而70%乙腈濃度又偏低，導致標準物質沒有很好的提取出來。通過圖表可以清楚的判斷出，含0.2%（v/v）甲酸的85%乙腈溶液的提取溶劑對11 種物質的提取效果最好，均滿足要求。

圖3 不同乙腈濃度下各化合物回收率對比Fig.3 Comparison of recoveries using different acetonitrile concentrations

研究甲醇濃度比例對各化合物的影響，分別選用含0.2%（v/v）甲酸的純甲醇、含0.2%（v/v）甲酸的85%甲醇溶液、含0.2%（v/v）甲酸的70%甲醇溶液，與乙腈的提取溶劑做相應對比，如圖4。從圖4中可以清晰的看出，甲醇對于賽庚啶基本提取不到，回收率幾乎均為零。賽庚啶是易溶于甲醇的，在過PRIME HLB 小柱時，均被吸附在小柱里，沒能洗脫出來。因此，不能選擇甲醇溶液作為提取溶劑。

圖4 不同甲醇濃度比例下各化合物回收率對比Fig.4 Comparison of recoveries using different Methanol concentrations

另外甲酸的添加對提取效果也有影響，見圖5。在85%乙腈溶液中分別不添加、添加0.1%（v/v）、添加0.2%（v/v）的甲酸溶液，添加1.0%（v/v）的甲酸溶液，觀察每種物質的回收率，不加甲酸的情況下，沙丁胺醇回收率只有40%，其他物質的回收率也均在60%～85%期間，而添加0.1%或0.2%的甲酸，提取效果非常好且基本相同，但是，溴莫尼定這種物質，提取液若是含0.2%，回收率在70%左右，比其他兩種提取液的回收率高一些，加酸可以促進其離子化，但是添加甲酸量到1.0%時，回收率沒有明顯改變，最后選擇添加0.2%（v/v）甲酸的85%乙腈溶液作為最終提取溶劑。

圖5 不同甲酸濃度下各化合物回收率對比Fig.5 Comparison of analyte recoveries using different concentrations of formic acid

2.2.2 凈化方式的選擇 本實驗采用三種凈化方式，方式一不凈化，方式二通過Waters Oasis PRiME HLB 通過式固相萃取小柱凈化、方式三通過Agilent EMR Lipid 凈化管凈化。結果見圖6，不進行凈化，直接上機，雖然有一定的回收率，但雜質較多，對儀器是有一定的損害的，并且基質的去除很有限，因此回收率偏低。其他兩種的凈化方式回收率相當，但溴莫尼定用EMR Lipid 凈化管，回收率比PRiME HLB低一些，因此選擇Waters Oasis PRiME HLB 通過式固相萃取小柱進行凈化。

圖6 不同凈化條件下各化合物回收率對比Fig.6 Comparison of recoveries using different clean-up methods

2.3 基質效應與溶劑效應

在農獸藥物殘留檢測方面，存在著兩方面的影響，一個是基質效應，由于樣品基質復雜，基質對分析過程會產生嚴重的干擾，另一個是溶劑效應，當樣品溶劑與流動相溶劑強度不同時，峰形可能前展或者拖尾，二者均會影響目標物的定量。

2.3.1 基質效應的影響 在運用質譜檢測的過程中，樣品基質會對實驗造成影響，對目標物有抑制或增強作用，統稱為基質效應，影響實驗結果的準確性和精密度。基質效應消除常用方法有同位素內標法[30?31]、空白基質匹配標準曲線法[32]、前處理方法優化[33]等，同位素內標法是消除基質效應最好的方法，但其缺點是同位素內標價格昂貴，不易購買。本文前處理方法中，使用PRIME HLB 小柱可去除部分基質，凈化后的樣品是否還存在基質效應的影響，可以利用流動相和空白基質提取液分別配制標準品的方式來驗證。

用流動相配制一份標準溶液，濃度為1 ng/mL，再按前處理步驟得到一份空白前處理液，用其配制濃度為1 ng/mL 的標準溶液，比較每種物質在流動相中和基質中的峰面積，得到基質響應相對強度（ME），若ME>100%，表明基質對離子起到增強作用，反之則為抑制作用，從表4中可以看出，除西馬特羅是基質增強外，其他均為基質抑制作用，而溴莫尼定、沙丁胺醇和特布他林的ME 值均在60%以下，說明基質對其抑制很嚴重，因此選擇用空白基質配制標準曲線。

表4 11 種物質標準溶液在空白基質提取液和初始流動相中的峰面積Table 4 Peak area of 11 substances in blank matrix extracting solution and initial mobile phase

ME（%）=基質標準峰面積/流動相標準峰面積×100

2.3.2 溶劑效應的影響 溶劑效應會影響物質的峰形與峰寬，因為前處理過程當中，所用提取液為85%乙腈水溶液，而儀器所用初始流動相為5%乙腈水溶液，樣品溶液的溶劑強度強于流動相溶劑強度時會造成的峰展寬、峰分叉現象，從而影響定量。為了減少溶劑效應，在進樣之前用流動相按1:1 比例稀釋，即可解決溶劑效應的問題。

2.4 線性范圍、回歸方程和檢出限

選取11 種物質濃度為1 mg/L 的標準物質中間液配制標準工作液，定容溶劑為空白基質溶液，在0.1～100 μg/L 的范圍內選取0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L 幾個濃度點，以濃度為橫坐標x，待測物峰面積為縱坐標y，繪制標準溶液工作曲線，呈現良好的線性關系，相關系數在0.9992～0.9999。以目標物在空白樣品中的3 倍SNR 值計算檢出限，檢出限為0.5 μg/kg，11 種受體激動劑的線性范圍、回歸方程和檢出限見表5。

表5 11 種物質的線性范圍、回歸方程、相關系數和檢出限Table 5 Linear ranges,regression equation,R2 and limits of detection (LODs) of 11 substances

2.5 方法的回收率和精密度

分別向空白豬肉樣品基質中添加各自的檢出限，2 倍檢出限，10 倍檢出限標準品，進行3 個水平的加標回收率試驗，按照本方法進行前處理，所得結果的平均回收率在81.3%～117.6%之間，RSD 值在0.7%～6.5%之間，具體數值見表6。

表6 11 種物質的加標回收試驗及精密度（n=6）Table 6 Recovery and precision for 11 substances (n=6)

2.6 實際樣品檢測

豬肉樣品30 批次，采用本文所建立的方法進行檢測之后，結果顯示，有2 批次克倫特羅檢出陽性樣品，分別為1.51 和2.13 μg/kg。用另一臺Waters UPLCMS/MS 檢測后，分別為1.46 和2.09 μg/kg，排出了內源性污染源的可能性。這兩批次豬肉為市集所購，市集攤位流動性大，豬肉來源不明，養殖戶添加了克倫特羅違禁藥物，因此本方法可以應用在風險監測樣品及突發事件的及時處置當中。

3 結論

本實驗采用通過式固相萃取小柱提取豬肉里的目標化合物，超高效液相色譜串聯質譜法檢測，建立了11 種受體激動劑同步測定的方法。該方法凈化步驟簡單，高效便捷，覆蓋多種受體激動劑，在耗材成本上大大縮減，與SPE 凈化方式相比，有著明顯的優勢?？紤]到溶劑效應，用1:1 比例稀釋凈化液即可消除影響。配合空白基質配制標曲的方式，基本消除了基質效應的影響，檢出限與國家標準相當[25?26]，回收率、精密度等均滿足要求。通過豬肉中的受體激動劑實際檢測結果可知，該方法有一定可靠性，可以很好地用于實際豬肉檢測當中。