電鏡技術在漿果采后保鮮研究中的應用

廖 嘉，胡文忠,*，龍 婭，趙曼如，楊香艷，李元政，姬亞茹,3

（1.大連民族大學生命科學學院，遼寧大連 116600；2.生物技術與資源利用教育部重點實驗室，遼寧大連116600；3.大連理工大學生物工程學院，遼寧大連 116024）

電子顯微鏡（Electron Microscope，EM）是利用電子與物質相互作用所產生的透射電子、彈性散射電子、能量損失電子、二次電子、背反射電子、吸收電子、X 射線、俄歇電子、陰極發光和電動力等信息來對不同樣品進行形貌觀察、結構測定等[1]。隨著科技的發展，EM 結合了高空分辨分析不僅可以獲得樣品區的形貌特征圖，還能進行原位化學成分及相結構的測定與分析、形貌觀測、結構鑒定等多功能的對照分析[2]，其與醫學、農業、生物、物理、化學、材料科學及食品科學等研究等的結合，使得EM 的功能逐漸擴大，同時它也促進了其他領域的飛速發展[3]。隨著顯微成像手段層出不窮，從用途及結構可將電子顯微鏡分為透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、反射電子顯微鏡和發射電子顯微鏡等多種類型，其中掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）和透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）兩大類[1]廣泛應用于果蔬加工及貯藏保鮮方面。

漿果是人們日常飲食中常見的一類水果，一般是指果皮較薄，肉多籽小，汁液豐富，成熟后呈漿液狀特點的肉質水果[4]，其品種繁多，例如藍莓、草莓、蔓越莓、葡萄等都是最常見的漿果，因其味道和顏色極其誘人，含有非常豐富的糖類、有機酸、氨基酸、維生素、酚類、花青素等多種特殊活性成分，對人體健康有益，深受廣大消費者歡迎，隨之市場需求量也逐年增加。但由于皮薄、含水量高，漿果極易在采摘和貯運過程中，因自身的成熟衰老、微生物侵染以及機械損傷而發生腐爛變質，所以保持或提升漿果貯藏品質，延長貯藏期便成為了漿果產業亟待解決的問題。近年來，電子顯微鏡被廣大學者應用于各類果蔬的貯藏保鮮技術的研究中，觀察果蔬在采后貯藏期間或經不同保鮮處理后的組織結構變化情況，使得人們更加直觀深入地了解果蔬成熟衰老機制以及各類保鮮技術對果蔬處理后的影響狀況，促進果蔬貯藏保鮮技術的不斷優化和發展。然而，電鏡技術在新鮮漿果的加工及貯藏保鮮研究過程中的應用依然較少，為了進一步觀察到真實的采后漿果果實表面形態及組織超微結構變化，使用電鏡提供輔助，便可探索不同處理對漿果的保鮮機制，尋求最佳的貯藏環境及保鮮技術。本文就電鏡技術在漿果采后病害防治及貯藏保鮮方面的應用現狀進行了闡述。

1 電鏡技術在采后漿果成熟衰老研究中的應用

漿果在采收后依然是一個鮮活的有機生命體，有序的進行著新陳代謝[5]，由于不能再從母體中獲得養分、水分等物質，只能靠分解代謝自身積累的有機物質，獲得生存所需的能量來維持生命活動，這會使果實內部特有的結構、成分產生不同程度的變化，加速了果實組織的衰老，從而導致果實的變質[6?7]。由此，需要通過電子顯微鏡技術的輔助，對采摘后漿果的表面、細胞形態變化及果實貯藏期間的超微結構變化等方面進行深入研究。

然而，漿果在貯藏過程中，其果皮、果肉組織結構都會發生復雜的變化，表1為一些常見漿果于貯藏期間的不同時段，能夠通過SEM 觀察果實組織表面形態、表皮光滑程度、細胞形態[18]以及TEM 觀察果肉細胞的細胞壁、葉綠體、線粒體等超微結構[19]?？梢姡煌臐{果果實在貯藏期間，其組織結構的變化既存在共同點，也有一定的差異，真實地反映了果實貯藏期內的生理變化情況。目前，電鏡技術在漿果保鮮方面多用于對不同生長發育時期果實微觀結構變化的觀察，為進一步探索最佳的延長新鮮果實貯藏期的保鮮技術打下扎實的基礎。

表1 電鏡對幾種常見漿果采后貯藏期內微觀結構的觀察Table 1 Observation of microstructure of several common berries during postharvest storage by EM

2 電鏡技術在漿果保鮮研究中的應用

由于營養豐富、美味可口，人們對漿果鮮果的消費量逐漸增加，推動著漿果產業的高速發展。但漿果自身較為脆弱同時還有季節性的限制，在其采摘后的包裝、運輸、貯藏等過程中，易受機械損傷與微生物侵染，若不做任何保鮮處理，即使放在0℃下，在2～3 周后也會腐爛變質，造成嚴重的經濟損失[20?21]。因此，許多學者研究適宜的技術對漿果采后進行貯藏保鮮，以延緩其成熟衰老的速率。利用不同類型的電子顯微鏡可從多方面研究果實在貯藏期內的形態及生理變化等，作為評估各類保鮮技術在控制漿果采后腐爛、延長果實貨架期等方面的重要參考之一[22]。

2.1 掃描電鏡在漿果保鮮研究中的應用

在研究不同保鮮方式處理漿果的過程中，可通過掃描電鏡觀察果實組織的表面形態、切面光滑程度以及細胞形態等方面的變化情況。Han 等[23]采用預冷和臭氧復合處理采后桑葚并于5±1 ℃下冷藏，并通過SEM 對果實亞超微結構的分析，發現預冷和臭氧復合處理組較對照組而言，果實表面氣孔規則，保衛細胞形態完整，細胞組織也沒有明顯的裂紋，顯著阻止果實表面組織的降解，使其形態特征得以保持，抑制了果實軟化。龍明秀等[24]利用保鮮盒包裝結合60Co-γ輻照處理藍莓，通過SEM 觀察，1.0 kGy輻照組的果皮形態變化較小，2.0 kGy 輻照組的藍莓果皮在貯藏初期便出現大量褶皺，進而說明低劑量輻照處理對保持藍莓果實的新鮮度，減少失水皺縮，延緩果實衰老具有顯著作用。李俊一等[10]以微孔防霧袋（厚度0.02 mm）包裝楊桃后在25 ℃環境下貯存，在貯藏第0、7、13 d 時經SEM 觀察發現，隨著貯藏時間的增加楊桃細胞結構開始松散，細胞褶皺變多，直到貯藏末期，已無法分辨單個完整細胞。張群等[25]將采用鈣聯合涂膜和熱處理采后葡萄后置于4±0.5 ℃低溫中貯藏，應用SEM 觀察到貯藏末期（40 d）經鈣聯合熱處理組的果肉組織疊層較多，且更稀疏，說明鈣聯合涂膜和熱處理對葡萄內果皮超微結構的損傷具有減輕作用，能較好地保持細胞結構的完整性，延緩自身溶解與軟化。Botelho 等[26]用2%木薯淀粉和0.01%肉桂精油混合涂膜處理番石榴后于25 ℃下貯藏，并利用SEM 對貯藏2、4、8 d 的果實進行觀察，發現隨著貯藏時間的推移，未經處理的果實在貯藏期內出現細胞排列不均勻、細胞壁降解的情況，而處理后的果實細胞初始形狀和細胞壁保持不變，有效維持果實的品質，延長了貨架期。

綜上可知，掃描電鏡可以從微觀世界直觀地分析果實表面損害程度、細胞結構的完整性、果肉組織褶皺度及氣孔開度等，結合研究新鮮漿果品質對應的生理生化指標，使得實驗結果形象清晰，可以更加全面地鑒別出各種處理方式對漿果保鮮效果的好與壞，因此，將掃描電鏡應用于采后漿果貯藏保鮮的深入研究與技術完善方面是非常必要的。

2.2 透射電鏡在漿果保鮮研究中的應用

隨著透射電子顯微鏡技術的逐漸完善，在采摘后漿果保鮮方面的應用也日趨增多，然而，通過透射電鏡便可觀察到漿果果實組織、細胞等的超微結構。Fernando 等[27]研究了不同劑量（2.4～47.8 J/cm2）的脈沖光照射處理對貯藏期間草莓的影響，其間通過TEM 觀察發現，脈沖光光照20 s 增強了草莓皮下細胞壁的完整性，同時細胞壁解體和細胞間接觸減少，有效阻止組織軟化，延長草莓的貨架期。李俊一等[10]采用微孔防霧袋（厚度0.02 mm）包裝楊桃于25 ℃環境中貯藏，利用TEM 觀察發現，對照組在貯藏7 d時楊桃便出現了細胞膜的消失及空腔化，而處理組貯藏至13 d 細胞壁致密度才明顯降低，細胞器減少，細胞膜消失，細胞基本空腔化，有效延長貯藏期。任亞梅等[28]以1 μL/L 的1-甲基環丙烯（1-MCP）熏蒸和充入1 μmol/L NO 分別處理獼猴桃，并置于0±1 ℃下貯藏。經TEM 觀察發現，在采后第8 周NO 處理的葉綠體已經出現了解體，而1-MCP 處理果的葉綠體在采后12 周仍然可見輪廓，表明1-MCP 處理的抑衰老效果優于NO 處理。Bu 等[29]利用4.2 kJ/m2UV-C 輻照處理櫻桃番茄，并在18 ℃貯存過程中結合TEM 觀察分析，貯藏30 d 時，對照果實的細胞壁松散，絲狀物排列分散，但處理組果實，雖然細胞間層不明顯，細胞壁則相對完整，直觀地表明UV-C 延緩了果實的軟化。María 等[30]將采后新鮮的無籽葡萄暴露于20 kPa CO2中低溫儲存13 d 后，再次充入20 kPa CO2處理3 d，結束后置于空氣中貯藏，經TEM觀察第41 d 果實結構發現，未處理葡萄的細胞壁質膜分離，線粒體嵴組織和葉綠體的類囊體結構完全喪失，而處理組果實，膜一直完全固定在細胞壁上，線粒體結構和葉綠體形態得到保持，外膜無破裂現象，充分的保持了最佳的果實質量。

由此可見，利用透射電鏡觀察果實細胞壁、細胞膜和各種細胞器的形態結構，可以輔助助探究漿果的成熟度及鉆研其衰老機理，為采后漿果尋找確定最適宜的貯藏環境或優化所使用的保鮮技術，以達到從根本上延緩新鮮漿果衰老，延長貯藏期的目的[19]。

2.3 其他電鏡在漿果保鮮研究中的應用

隨著電子顯微技術的逐步完善，目前還出現了透射掃描電子顯微鏡（TSEM）、環境掃描電子顯微鏡（ESEM）、冷凍掃描電子顯微鏡（Cryo-SEM）、低溫掃描電子顯微鏡（LT-SEM）、場發射掃描電子顯微鏡（FESEM）[18,31]等多種用途的電子顯微鏡，而今在采摘后漿果的貯藏及保鮮方面的應用也日趨增多。Wang 等[32]通過TSEM 觀察對比了采用γ射線照射處理和未經處理的藍莓果實在貯藏35 d 后的細胞變化情況，展現出對照組果實細胞壁明顯退化，而處理組的細胞壁厚度均勻，纖維排列整齊，細胞壁只發生初步降解。Blanch 等[33]則利用低溫掃描電子顯微鏡（LT-SEM）觀察經不同濃度CO2處理后草莓果實的細胞間水分分布和細胞組織完整性，結果表明，高濃度CO2處理可防止草莓失重和細胞結構的紊亂，從而最大限度地減少結構損壞。而王兢業[34]在ESEM下觀察經1-甲基環丙烯（1-MCP）和殼聚糖復合涂膜液結合處理后草莓的細胞壁情況，結果發現，與未處理組相比細胞堅挺飽滿，蜂房結構明顯且完整，細胞壁降解程度較低，這對維持細胞壁穩定，延緩草莓軟化有較好的效果。

但由于漿果果實柔軟多汁的特殊性，目前處理樣品及制片的難度大大增加，導致反射電子顯微鏡和發射電子顯微鏡等多種類型的電子顯微鏡依然未能在漿果保鮮方面進行廣泛的應用。因此，在生物科學技術的發展過程中，需要對各技術進行不斷完善，使得電鏡技術在新鮮果蔬保鮮方面得到更深層次的應用。

3 電鏡技術在漿果采后病害防治研究中的應用

漿果成熟于高濕高溫的季節，極易在采收后和商業處理期間受到不同病原微生物的侵染而導致果實腐爛及產量損失，而微生物中所產生的許多真菌毒素會引起嚴重的食品安全問題。因此，各學者使用生物防治、天然植物提取物控制等方法對采后漿果進行病害防治，并通過電子顯微鏡輔助觀察，研究真菌形態和經處理后的生理變化情況，評估各保鮮技術在控制漿果采后腐敗方面的潛在應用，以提高新鮮漿果采后食用的安全性[21?22,35]。

從表2總結的不同電鏡在幾種常見漿果病害防治中的應用效果可以看出，各類漿果在經不同防治方式處理前后，其主要病原菌的表面形態和細胞結構都產生了很大的變化。一般情況下未經處理進行貯藏的漿果果實表面的病原菌菌絲生長旺盛，表面光滑，細胞內外結構完整，而經防治處理后，可以明顯地觀察到侵染果實的病原菌不僅出現褶皺扭曲，菌絲斷裂的情況，其細胞結構也嚴重受損，甚至產生解體，很直觀地證明各防治技術能抑制病原菌生長，達到漿果貯藏期間病害防治的目的，為今后改善各類保鮮技術提供了重要研究支撐。

表2 電鏡技術在漿果采后病害防治研究中的應用Table 2 Application of EM in the control of postharvest diseases of berries

續表2

4 展望

隨著漿果類果品在市場及人們生活中所占比重的逐年增長，對其貯藏保鮮、病害防治等方面的研究是必要的。目前，電鏡技術主要集中于新鮮漿果采后病害防治方面，也有較少學者采用電鏡觀察漿果生長、成熟、貯藏等過程中的變化情況，為確定果實最佳貯藏環境和保鮮技術提出了可供利用的資料。在長期鮮果貯藏保鮮的探究中，若結合電鏡觀察不同處理對新鮮漿果的保護效果，可從根本上抑制鮮果在采收、貯藏、運輸和銷售環節中出現的腐敗變質現象，達到延長漿果貨架期的目的，促進漿果產業的發展。然則，在進行電鏡觀察前處理時，由于漿果自身質地及其柔軟且果皮薄、汁液多，切片過程中無法得到與其他品類的果蔬一樣完整的樣品切片，反復拖拉刀片極易損害細胞組織，導致電鏡下觀察結果出現較大偏差，甚至無法觀察到完整的組織細胞，因此在制備樣品期間需進行大量重復操作，提高切片的有效性和完整性，以保證樣品組織及細胞觀察結果的真實性[19]。隨著生物科學技術的不斷發展，各研究水平的日益上升，電鏡技術在探尋果實生長發育期間的超微結構及其生理生化變化關系的過程中將成為有力武器，促使研究者更加深入全面地闡明果實成熟衰老機理[15]，篩選培育出耐貯藏的漿果新品種[17]，使電鏡技術在漿果采后研究中得到廣泛應用，為廣大學者的深入鉆研提供更優的技術支持。