適配體生物傳感器檢測食品中鏈霉素的研究進展

彭海帥，王畢妮，惠媛媛，張富新，劉玉芳，趙愛青，任 榮，賈 蓉

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安 710119）

因此，STR 在食品中的殘留引起了各國高度重視。國際食品法典委員會（Codex Alimentarius Commission，CAC）規定在牛奶中最大殘留限量（Maximum Residue Limit，MRL）為200 μg/kg，在雞肉、豬肉中MRL 均是600 μg/kg[4]。2002年我國農業部《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規定，牛奶中MRL 為200 μg/kg，畜禽肌肉中為600 μg/kg[5]。在這些標準的要求下，STR 的檢測成為動物性食品和飼料中的研究熱點。國內外已經報道的傳統的STR 檢測方法包括：親水相互作用液相色譜法（ Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography，HILIC）[6?7]、酶聯免疫法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）[8?9]、液相色譜-串聯質法（Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）[10?13]等。雖然這些方法靈敏度高、重現性好，但是樣品處理復雜、檢測成本較高、且需專業人員操作，因而極大地限制了它們在STR 快速檢測方面的應用。生物傳感器作為一種快速檢測技術，由識別元件（抗原、抗體、酶、適配體、微生物、細胞、組織等）、信號轉導元件和信號放大元件三個部分[14]構成。識別元件中的適配體由于具有優良檢測性能而被廣泛用于生物傳感器的構建中。隨著光學、電化學技術的發展，基于適配體的光學、電化學生物傳感器在食品檢測行業應用廣泛[15?16]。本文綜述了近五年基于適配體的光學、電化學生物傳感器在STR 檢測中的研究進展，以期為STR 生物傳感器的進一步發展提供參考與借鑒。

1 基于適配體的生物傳感器

適配體（Aptamers，Apt）作為生物傳感器識別元件之一，是通過指數富集的配基系統進化技術（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX）篩選出的單鏈寡核苷酸或肽（通常是DNA 或RNA），長度一般為25～60 個堿基[17]，分子質量約6～40 kDa，解離常數通常在納摩爾至皮摩爾范圍內，以A-T（A-U）、G-C 堿基對形成發夾、假結或凸環等二級結構[18]。具有與靶標分子（例如小的有機分子、多肽、蛋白質、離子等）特異性識別的能力，其原理與單克隆抗體類似：適配體和靶分子之間通過氫鍵、范德華力、堿基堆積等各種作用進行形狀互補型識別[19]，但與抗體相比適配體具有更高的特異性與親和力、易于通過化學合成和體外篩選獲得、可結合的靶標物質的范圍更寬、分子量小、具有良好的穩定性和可重復性的優勢[20?21]。

以上優點使適配體廣泛應用于構建生物傳感器。基于適配體的生物傳感器是利用適配體獨特的立體結構與靶標分子特異性結合，通過信號傳導元件將生物反應轉變為光、電等可識別的信號，實現對靶標分子檢測的生物傳感技術。

2 基于適配體的光學生物傳感器

將適配體傳感器與光學檢測技術結合形成的光學傳感器具有操作簡便、靈敏度高、響應快等優點[22]。根據反應機制不同，可為以下幾類：基于適配體的化學發光傳感器、基于適配體的熒光傳感器、基于適配體的比色傳感器等，在STR 快速檢測中的應用如下（見表1）。

表1 鏈霉素光學適配體傳感器Table 1 Streptomycin optical aptamer sensor

2.1 基于適配體的化學發光傳感器

化學發光（Chemiluminescence，CL）的檢測原理是：由于化學反應會產生大量能量，誘導電子從基態躍遷到激發電子態，同時能量以光輻射的形式釋放出來，產生化學發光現象，在分析化學中具有背景噪聲小、安全可控等優點。基于化學發光原理設計的適配體傳感器具有裝置成本低廉、不需要外部光源、檢測線性范圍較寬等優點[20,23?24]。Sun 等[25]基于適配體和G-四鏈體DNA 酶修飾的三維石墨烯復合材料，成功制備了CL 傳感器用于檢測STR。其中β-環糊精和離子液體功能化的氧化石墨烯氣凝膠（β-CD/IL@GOGA）作為骨架時具有較大的比表面積，適配體（Apt）和G-四鏈體DNA 酶分別修飾在骨架上，當STR 存在時，由于STR 和Apt 之間的特異性識別，使G-四鏈體DNA 酶從骨架上釋放出來，催化了魯米諾-H2O2的CL 反應，實現了STR 的間接檢測。該CL 傳感器線性范圍為1.4×10?12～2.8×10?9mol/L，檢出限為9.2×10?14mol/L。

基于適配體CL 傳感器有諸多優點但CL 檢測強度容易受到檢測系統中共存基質的干擾，強度也較弱，在選擇靈敏性方面有待提升[25?26]。

2.2 基于適配體的熒光傳感器

一些物質經過紫外光的照射后，原子被激發發生原子能級躍遷從而反射出各種可見光，使物質呈現熒光現象[14]。基于熒光現象的適配體傳感器具有操作簡單、選擇性好、可以實時檢測等獨特優勢[27]。熒光傳感器（Fluorescent sensor）可以將分子識別信息轉換成熒光信號，一般由熒光團（Fluorophore）通過連接基（Spacer）與受體（Receptor）相連而成。其中熒光團是一種信號傳遞物質，可將識別信息轉換成光學信號[28]。Taghdisi 等[29]設計了一種基于核酸外切酶III （ExoIII）、SYBR Gold 和適配體互補鏈的熒光傳感器，用于靈敏檢測STR。在沒有STR 的情況下，熒光強度較弱。加入STR 后，適配體與靶標（STR）結合，導致互補鏈從適配體中釋放出來，加入SYBR Gold 后，熒光強度會增強。該傳感器對STR 具有很高的選擇性，檢出限低至54.5 nmol/L。Emrani 等[30]設計了基于金納米顆粒（AuNPs）和雙鏈DNA（dsDNA）熒光猝滅適配體傳感器，用于STR 快速檢測。在不存在STR 的情況下，適配體和互補dsDNA（已被FAM 標記）的結合是穩定的，此時有強烈的熒光。當存在STR 時，適配體與靶標（STR）結合，使互補dsDNA 被釋放出來并且吸附在AuNPs 的表面上，此時互補dsDNA 上的熒光會被AuNPs 淬滅。該方法的檢出限為47.6 nmol/L。

熒光傳感器可以快速、簡便地檢測目標物，但有些熒光團容易發生光漂白，影響發射強度，進而難以獲得較低的檢出限。另外有些熒光團存在毒性對細胞有害[31?33]。因此，仍需進一步提升熒光傳感器的靈敏度和安全性。

周大偉和周小偉兄弟倆，周大偉在濟南工作，每月寄給生活在臨沂老家的父母1500元生活費；周小偉在農村老家，以種地為生，掙錢少，也不需要稅前扣除，每月給父母500元生活費。周大偉可以每月稅前扣除1500元甚至2000元嗎？

2.3 基于適配體的比色傳感器

比色法（Colorimetry）是通過比較或測量溶液對光選擇性吸收而產生的可視化顏色來確定待測組分含量的方法，與其他檢測方法（化學發光、熒光、電化學等）相比，僅需要用裸眼觀察，不需要復雜的儀器，非常適合即時檢測（Point-of-care testing,POCT）[34]，POCT 是一種在采樣現場即刻進行分析，樣本無需復雜處理的一類快速檢測方法。近年來，智能手機的普及和生物傳感器技術的進步促進了POCT 的發展[35]。目前POCT 比色傳感器已廣泛應用于食品安全、環境監測、醫學研究等領域。

Luan 等[36]開發了POCT 適配體比色傳感器，以多孔SiO2微珠-酶聯聚合物（Power VisionTM，PV）作為比色探針，核酸外切酶輔助的靶標循環檢測STR。在STR 和核酸外切酶I（Exo I）存在下，比色探針上的Apt 將捕獲STR 形成復合物（STR/Apt-Au-PV），Exo I 消化STR/Apt-Au-PV 上的Apt，釋放的STR 可以參與新的循環。此外，在PV 上標記大量辣根過氧化物酶（HRP）可以進一步高效催化H2O2-TMB（3,3,5,5 四甲基聯苯胺）系統進行顯色，然后通過紫外分光光度計進行檢測。該方法的檢出限是1 pg/mL，檢測范圍是0.003～20 ng/mL。Lin 等[37]通過智能手機的數字圖像比色法建立了POCT 法快速檢測STR。過量的適配體與互補DNA 雜交形成dsDNA，SYBR Green I 與dsDNA 結合后發出明顯的綠色熒光。當STR 與適配體結合后，熒光強度會降低。在智能手機上安裝Touch Color 應用程序，通過使用數字圖像比色法讀取圖像的RGB 值，其中G 值和STR 濃度之間存在線性關系。該方法的檢出限為94 nmol/L，線性范圍是0.1～100 μmol/L。

基于適配體的POCT 比色傳感技術有效地減小了檢測設備的體積、降低了檢測成本、縮短了檢測時間[38]，但是目前基于智能手機POCT 生物傳感器大多數仍處于概念階段，要實現商業化還有很長的路要走[35]。

3 基于適配體的電化學生物傳感器

基于適配體的電化學傳感器通過生物識別元件（適配體）與目標物特異性結合，引起電極表面電化學信號變化，通過檢測信號變化測定目標物含量[39?40]。該方法在STR 檢測中的應用如下（見表2）。

表2 鏈霉素電化學適配體傳感器Table 2 Streptomycin electrochemical aptamer sensor

貴金屬納米顆粒[41]、碳基納米材料[42]、磁性納米粒子[43]和量子點[44]、光敏材料等，可以增加傳感器的電化學響應，實現信號放大策略。其中光敏材料會引起光電化學（Photoelectrochemistry,PEC）過程：光敏材料吸收光子后，經過電荷分離、電荷轉移等過程，在傳感界面形成電子-空穴對，產生了光子到電的轉換，從而引起光電信號響應[45?46]。將PEC 過程與適配體傳感器結合形成的PEC 適配體傳感器已廣泛應用于STR 快速檢測。

3.1 基于貴金屬納米材料的電化學生物傳感器

貴金屬納米材料由于具有極佳的比表面積和活性催化位點，促進待測分子與電極之間的電子轉移，從而有效放大電化學傳感器的分析信號[41]。Ghanbari等[47]采用AuNPs 和硫醇石墨烯量子點（Thiol Graphene Quantum Dots，GQD-SH）作為檢測STR 的納米材料，構建了電化學適配體傳感器。構建過程首先將GQD-SH 固定在玻璃碳電極（GCE）的表面上，其次將AuNPs 通過Au-S 鍵固定在GQDs 的SH 基團上，最后將適配體共價吸附在AuNPs 表面上。當STR 存在時，STR 會與適配體結合形成復合物，通過檢測電化學信號測定STR 的含量。該方法的檢測范圍是0.1～700 pg/mL，檢出限為0.033 pg/mL。Li 等[48]用Pt-Sn 納米顆粒裝飾TiO2納米棒表面，得到具有強電催化性能的金屬復合材料（Pt-Sn@TiO2），然后根據Pt-Sn@TiO2復合材料和核酸外切酶輔助的靶標循環雙信號放大策略開發了一種電化學適配體傳感器，用于STR 的檢測。Pt 和Sn 之間的協同作用，可以增強氧化還原電流，實現信號放大策略。RecJf核酸外切酶通過選擇性切割STR-Apt 復合物，釋放出的STR 可與電極上的Apt 再次結合，形成靶標循環信號放大策略。該方法的檢測范圍是0.05～1500 nmol/L，檢出限為（0.020±0.0045）nmol/L。Roushani 等[49]將介孔氧化硅薄膜（Mesoporous Silica Films，MSFs）涂在金電極表面，用銀納米粒子（AgNPs）修飾MSFs，構建電化學適配體傳感器檢測STR。在STR 存在下，STR 會結合在適配體上并阻止[Fe（CN）6]3-/4-氧化還原探針在中孔膜的納米通道擴散，從而降低電化學信號。在最優條件下該傳感器的檢測范圍是1 fg/mL～6.2 ng/mL，檢出限為0.33 fg/mL。

以金（Au）、鉑（Pt）、銀（Ag）為代表的貴金屬納米材料與其他材料結合產生協同作用，可以促進傳感器電子轉移，實現STR 靈敏檢測，具有極好的生物傳感前景。

3.2 基于碳基納米材料的電化學生物傳感器

碳基納米材料中的有序介孔碳（Ordered Mesoporous Carbon，OMC）具有高導電性、高穩定性、較大的比表面積等優點，為構建電化學傳感器提供理想的納米平臺[50]。Li 等[51]基于碳納米纖維（Carbon nanofibers，CNFs）和有序介孔碳-金納米粒子（OMCAuNPs）構建的電化學適配體傳感器，用于檢測卡那霉素（Kanamycin，KAN）和STR。在OMC 中引入AuNPs 可以提升電子轉移性能、改善納米材料的生物相容性。在沒有KAN 和STR 的情況下，適配體與其互補鏈結合。加入KAN 和STR 后，適配體分別與各自的靶標（KAN、STR）結合，導致互補鏈被釋放出來，通過電流峰的變化測定KAN、STR 含量。在最佳條件下，該傳感器對KAN 和STR 檢出限分別為87.3 和45.0 pmol/L，檢測范圍均為0.1～1000 nmol/L。石墨化的多壁碳納米管（MWCNTGr）具有較高的電荷轉移性能，同時還具有網絡結構，可以固定更多的適配體[52]。Li 等[53]基于MWCNTGr和CNFs-AuNPs納米復合材料，構建電化學適配體傳感器同時檢測KAN 和STR。以金屬離子（Cd2+和Pb2+）作為信號示蹤劑標記KAP（KAN適配體）和STP（STR 適配體）。當KAN 和STR 存在時，KAP 和STP 從它們的互補鏈中釋放出來，Cd2+和Pb2+會產生不同的微分脈沖伏安（Differential Pulse Voltammetry,DPV）峰，在最佳條件下，該方法對KAN 和STR 的檢出限分別是74.50 pmol/L 和36.45 pmol/L，檢測范圍均是0.1～100 nmol/L。

在電極表面化學修飾不同的材料，構建的電化學傳感器可以實現不同待測物質的同時檢測，用碳基納米材料修飾的電極既擁有碳納米材料的優良性質，同時又能提高電極本身的電化學信號，極大地提高了傳感器的準確性和靈敏度。

3.3 基于磁性納米材料的電化學生物傳感器

磁性納米顆粒（例如Fe3O4）電化學傳感器中應用廣泛[54]。Yin 等[55]以多孔碳納米棒（Porous Carbon Nanorods，PCNR）和石墨烯-Fe3O4-AuNPs 納米復合材料作為基質，構建電化學適配體傳感器用于STR的靈敏檢測。在石墨烯（Graphene，GR）和Fe3O4納米粒子中引入AuNPs 有利于提升納米材料與適配體的結合。當適配體與STR 結合后，會使電流發生變化，在最佳條件下，該方法的檢測范圍是0.05～200 ng/mL，檢出限是0.028 ng/mL。Yin 等[56]將金納米粒子功能化的磁性多壁碳納米管（Au@MWCNTs-Fe3O4）復合材料和納米孔PtTi（NP-PtTi）合金依次滴到玻璃碳電極（GCE）表面上來制備適配體傳感器。Au@MWCNTs-Fe3O4復合材料作為生物分子固定基質，有效連接適配體；NP-PtTi 合金明顯增強電化學信號，提高檢測靈敏度。在最佳條件下，該傳感器檢測范圍是0.05～100 ng/mL，檢出限是7.8 pg/mL。

Fe3O4作為一種對環境友好的磁性納米顆粒，由于可以在Fe2+和Fe3+之間發生電子轉移而表現出良好的導電性能，通常與碳基納米材料和金屬納米材料結合使用，在構建電化學適配體傳感器中具有廣闊的應用前景。

3.4 基于光敏材料的PEC 適配體傳感器

PEC 生物傳感器將光電轉換技術與生物傳感技術相結合，既延續了電化學生物傳感器的優點，如穩定性好、靈敏度高等，同時又具有光學傳感器的優勢和潛力，如操作便捷，響應速度快等。目前PEC 生物傳感器中常用的光敏材料有金屬氧化物（TiO2[57?58]、WO3[59]、BiVO4[60]）、過渡金屬化合物（CdTe[61]、CdS[62]）等。Luo 等[63]將TiO2/BiOI/BiOBr 作為可見光光敏材料，適配體作為生物識別元件，開發了一種新型的鏈霉素PEC 適配體傳感器。適量的TiO2與BiOI/BiOBr 組合可增強光電流響應，當STR 與適配體特異性結合后會使光電流響應發生變化。在最佳條件下，該方法檢測范圍是0.05～150 nmol/L，檢出限低至0.04 nmol/L。Okoth 等[60]將鉬（Mo）摻雜BiVO4的復合物（Mo-BiVO4）和石墨烯納米復合材料作為光敏材料構建可見光驅動的鏈霉素PEC 適配體傳感器，當不存在STR 時，由于適配體具有位阻，PEC 適配體傳感器顯示出較弱的光響應。當存在STR 時，STR 與適配體特異性結合，由于光生空穴對STR 的氧化作用使傳感器的光電流響應增強。在最優條件下，該PEC 適配體傳感器的檢測線性范圍是0.1～100 nmol/L，檢出限為0.0481 nmol/L。Xu 等[64]將CdTe量子點（Quantum Dots，QDs）和單壁碳納米角（SWCNHs）合成一種新型納米復合材料（CdTe-SWCNHs）并將其作為光敏材料，制備了鏈霉素PEC適配體傳感器。其中SWCNHs 可以抑制電子-空穴對的重組，在加快電子轉移的同時提高光電流強度[64?65]。當適配體與CdTe-SWCNHs 結合后，PEC信號明顯受到抑制。當STR 與適配體結合后會使適配體從修飾的電極表面脫落，PEC 信號恢復。在最佳條件下，檢測線性范圍為0.1～50 nmol/L，檢出限為0.033 nmol/L。Shen 等[66]提出了一種基于光電化學“信號接通”和電化學“信號斷開”雙重檢測模型。CdTe QDs 和亞甲基藍（Methylene Blue,MB）標記的適配體（MB-Apt）分別用于生成PEC 信號和電化學（Electrochemistry,EC）信號。目標物STR 會誘導MB-Apt 的構象發生變化，將MB 推離電極，EC信號降低；于此同時空間位阻減少有助于CdTe QDs 還原PEC 信號，使PEC 信號升高。在最佳條件下該方法的檢測線性范圍是0.03～100 μmol/L，檢出限為10 nmol/L。

p-n 異質結構和Z-scheme 異質結構是由兩種半導體組成的高效光催化劑[67]，目前已廣泛應用于PEC 傳感器中。Xu 等[68]基于LaFeO3@g-C3N4p-n異質結構，成功開發了一種PEC 生物傳感器用于STR 的靈敏檢測。其中LaFeO3@g-C3N4p-n 異質結構具有核-殼結構，可以明顯提高可見光響應和電荷分離效率。當適配體固定在LaFeO3@g-C3N4上后，光電流強度降低。當適配體與STR 結合后，光電流信號進一步降低。在最優條件下的檢測范圍是0.01～10000 nmol/L，檢出限為0.0033 nmol/L。Liu等[59]用CdTe QDs 與WO3納米片構建新型的Zscheme 異質結構，用于STR 的快速檢測。Z-scheme異質結構通過模擬綠色植物的光合作用，可實現接近100%的電荷分離量子效率[69?70]，應用在PEC 傳感器中可以提高光電流響應。當適配體與STR 結合后，由于空間位阻增大導致光電流降低。該方法的檢測線性范圍是1.5～728.5 μg/kg，檢出限為0.5 μg/kg。

以上四種電化學適配體傳感器雖然具有樣品處理簡單、易于小型化、具有良好的重現性、選擇性和檢測靈敏度等優點，但目前還只是建立在實驗室階段。

4 結論與展望

近年來隨著科學技術的進步，生物傳感器技術也得到飛速發展。與其他識別元件相比適配體具有更高的穩定性、更易合成與修飾、成本更低等優點而廣泛應用于生物傳感器中。本文綜述了近五年基于適配體的光學、電化學生物傳感器傳感器在STR 快速檢測中的應用，其中光學傳感器（以化學發光、熒光、比色為例）可以實現可視化即時檢測，但是在安全性（某些熒光團有毒）、選擇性（易受檢測體系中其他物質干擾）等方面有待改善；電化學傳感器具有易于小型化、樣品無需復雜處理、靈敏度較高等優點，但要實現工業化應用仍有較長的路要走。

綜上所述，不同的生物傳感器各有利弊，需要根據食品樣品特點和應用需求選擇合適的檢測方法。為實現STR 生物傳感器朝著簡單、快速、成本低、靈敏度高、現場即時檢測的方向發展，在今后的研究中：隨著納米技術的不斷發展，新型功能性納米材料層出不窮，該材料具有較強的吸附能力、良好的生物相容性，可以加快電子傳遞、放大電流信號等優點。因此,擴大功能性納米材料的選用范圍，有望為生物傳感器的研究和應用提供新途徑；將生物傳感器與其它技術（光學、電化學等）的聯用建立一個較為完整的多組分快速檢測平臺，滿足食品中多種抗生素的快速檢測。該平臺對提高檢測效率、降低檢測成本有重要的實際意義。