莫能菌素高產(chǎn)菌株的選育

李子勇，李云飛，曾曉寧，梁景樂(lè),2

（1.山東勝利生物工程有限公司 山東濟(jì)寧 272000；2.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司 北京 100070）

莫能菌素（Monensin）亦稱莫能霉素、肉桂霉素和瘤胃素莫能菌素，屬五環(huán)多醚結(jié)構(gòu)的酸性抗生素，它是由美國(guó)禮來(lái)公司（Eli Lilly）首先研制成功，在1967 年首先由Haney 等人從肉桂地鏈霉菌（Streptomyces cinnamonensis）的發(fā)酵液中分離得到，為聚醚類離子載體抗生素中應(yīng)用最為廣泛的藥物之一[1]。

莫能菌素具有廣譜的抗球蟲活性，用于雞球蟲病防治和肉牛促生長(zhǎng)。對(duì)革蘭氏陰性菌無(wú)作用；但對(duì)葡萄球菌、桿菌、梭菌、鏈球菌、霉菌（青霉菌、念珠菌）有一定的抑制作用。莫能菌素主要作為飼料添加劑直接飼喂動(dòng)物，根據(jù)近年學(xué)者研究報(bào)道，對(duì)反芻動(dòng)物作用主要是抑制瘤胃內(nèi)革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)，提高瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸比例，抑制甲烷的產(chǎn)生，提高飼料能量的利用率，減少機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的浪費(fèi)，從而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，改善飼料轉(zhuǎn)化率。莫能菌素還能抑制乳酸產(chǎn)生菌的活性，減少乳酸的數(shù)量，預(yù)防動(dòng)物乳酸中毒[2]。肉桂地鏈霉菌作為莫能菌素的生產(chǎn)菌種，其生產(chǎn)能力直接影響著發(fā)酵水平，而且生產(chǎn)企業(yè)使用的菌種一般為人工選育的非自然高產(chǎn)菌株，其次遺傳性能具有不穩(wěn)定性，必須經(jīng)常對(duì)其進(jìn)行菌種選育，以保障生產(chǎn)性能。目前工業(yè)化生產(chǎn)的抗生素菌株主要通過(guò)誘變育種獲得，李依韋等[3]利用紫外誘變與化學(xué)誘變得到產(chǎn)量提高16.65%的高產(chǎn)菌株。秦艷飛等[4]通過(guò)紫外-氯化鋰誘變并結(jié)合氨基酸抗性篩選得到高產(chǎn)菌株產(chǎn)量提高72.5%。隨著生物技術(shù)的發(fā)展成熟，基因工程技術(shù)也被應(yīng)用于菌種選育，但由于其對(duì)技術(shù)和設(shè)備要求比較高，過(guò)程復(fù)雜，費(fèi)用較大，且成功率較低，誘變育種仍是工業(yè)菌種選育最為有效的手段[5]。

本文在紫外-氯化鋰雙重誘變基礎(chǔ)上[6]，結(jié)合瓊脂塊法篩選、搖瓶篩選誘變菌株，得到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的肉桂地鏈霉菌菌株，經(jīng)過(guò)冷凍保藏和傳代驗(yàn)證后，生產(chǎn)能力保持穩(wěn)定傳遞，運(yùn)用到發(fā)酵車間大生產(chǎn)后，可大大提高發(fā)酵生產(chǎn)效率。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種原始菌種：MON17042，山東勝利生物工程有限公司生產(chǎn)用菌種。生物測(cè)定指示菌：枯草芽孢桿菌，山東勝利生物工程有限公司保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基平板和斜面培養(yǎng)基：淀粉2%、瓊脂粉2.5%、硝酸鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、硫酸亞鐵0.1%、氯化鈉0.05%、磷酸氫二鉀0.05%。

種子瓶培養(yǎng)基：口服葡萄糖0.5%、糊精2%、黃豆餅粉1.5%、酵母粉0.25%。

發(fā)酵瓶培養(yǎng)基：黃豆餅粉3.5%、口服葡萄糖3.5%、豆油2.0%、硫酸銨0.2%、氯化鋅0.03%、硫酸鎂0.007%、硫酸亞鐵0.005%、VC 0.0002%、磷酸氫二鉀0.005%、碳酸鈣0.25%。

1.1.3 試劑葡萄糖、酵母粉、淀粉、瓊脂粉、碳酸鈣、氯化鈉、氯化鋅、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸亞鐵等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器設(shè)備高效液相色譜儀，沃特世中國(guó)有限公司；SPH-322TD 型敞開(kāi)式搖瓶機(jī)，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SCB-1520 型超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SPX-250B-2 型生化培養(yǎng)箱，上海博訊儀器有限公司；紫外線誘變箱，濟(jì)南杰康凈化設(shè)備廠；磁力攪拌器，南通麥格磁力機(jī)械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 單孢子懸液制備將原始菌液梯度稀釋后涂布于分離培養(yǎng)基表面，33℃培養(yǎng)9～12d，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落傳斜面，作為出發(fā)菌株。向培養(yǎng)好的新鮮孢子斜面中加入10mL 的無(wú)菌水，用接種環(huán)將孢子刮下，振蕩打碎20～30min，四層濾紙過(guò)濾，得單孢子懸液[7]。

1.2.2 菌種的紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變吸取MON17042 菌株的孢子懸液5mL 置于帶磁力攪拌器的平皿中放在紫外燈下進(jìn)行照射，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，UV 誘變的條件是：紫外燈功率20W，照射距離20cm，照射時(shí)間50s，誘變后把孢子懸液均勻涂布在加有1.0%氯化鋰的分離平板上，每個(gè)平板約滴入0.2mL 孢子懸液，共接分離平板20 支，33℃培養(yǎng)9～12d[8]。

1.2.3 瓊脂塊初篩待平皿剛剛長(zhǎng)出針尖樣菌落時(shí)，用打孔器連同下面的瓊脂一起取出，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌空平皿，保持相同的濕度，33℃培養(yǎng)3d。把每一長(zhǎng)滿單菌落的瓊脂塊移至已混有指示菌的大塊瓊脂平板，33℃培養(yǎng)4d，分別測(cè)定各瓊脂塊的抑菌圈，并用原始菌株做對(duì)照。

1.2.4 搖瓶復(fù)篩挑選抑菌圈較大的單菌落傳斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)成熟后編號(hào)保存，并轉(zhuǎn)接搖瓶進(jìn)行復(fù)篩。搖瓶培養(yǎng)采用二級(jí)培養(yǎng)，挖取新鮮斜面（1cm× 1cm）接至裝有25mL 種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，轉(zhuǎn)速200rpm，33℃培養(yǎng)20～26h 后，轉(zhuǎn)至裝有50mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL 發(fā)酵瓶中培養(yǎng)，接種量6%，8 層紗布用線繩扎緊，220rpm，33℃培養(yǎng)10d。

1.2.5 效價(jià)測(cè)定高效液相色譜—柱后衍生化—紫外檢測(cè)法[9]分離測(cè)定發(fā)酵液效價(jià)：用甲醇—水提取發(fā)酵液中的莫能菌素，以甲醇—冰乙酸—水（體積比94:3:3）作為流動(dòng)相，香草醛為衍生劑，流動(dòng)相和衍生劑流速均控制0.7mL/min，反應(yīng)溫度95℃，采用C18的色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)520nm，進(jìn)樣量20μL。

1.2.6 穩(wěn)定性考察得到的高產(chǎn)突變株進(jìn)行傳代和4℃冰箱保存試驗(yàn)，以觀察其傳代穩(wěn)定性和4℃冰箱保藏過(guò)程中生產(chǎn)能力的穩(wěn)定性。本研究考察了突變株1～5 代在4℃冰箱斜面分別保藏30、60、90、120d 的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量水平，以觀察其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選結(jié)果

經(jīng)誘變處理后，從分離平板中挑出26 個(gè)抑菌圈較大的菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定效價(jià)，得到3 株產(chǎn)量明顯超過(guò)原始菌，且每株增長(zhǎng)幅度均在35%以上。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 突變菌株與出發(fā)菌株對(duì)照

2.2 遺傳穩(wěn)定性考察結(jié)果

將3 支高產(chǎn)菌株在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)進(jìn)行0～4℃保存、傳代，同等條件下?lián)u瓶發(fā)酵后再測(cè)定其放瓶效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 突變菌株傳代、冷藏后的搖瓶發(fā)酵表現(xiàn)（μg/mL）

從表2 可知高產(chǎn)突變菌株連續(xù)傳代5 次，其發(fā)酵能力幾乎沒(méi)有下降，保持比較穩(wěn)定。從第6 代開(kāi)始有一定幅度的下降，但并不影響其總體發(fā)酵能力。菌種保藏時(shí)間比較試驗(yàn)顯示，在0～4℃的溫度條件下保藏菌種，4 個(gè)月后菌種代謝能力稍有下降，但總體變化不大。現(xiàn)階段該莫能菌素發(fā)酵生產(chǎn)一般使用F2 斜面作為生產(chǎn)菌種接瓶進(jìn)罐，每批進(jìn)罐菌株的制作間隔原則上也不會(huì)超過(guò)三個(gè)月，所以新篩選菌種的穩(wěn)定性完全可以滿足生產(chǎn)的需求。

2.3 篩選菌株發(fā)酵大生產(chǎn)驗(yàn)證

用驗(yàn)證過(guò)的009#、082#和116#菌株各選一支F2 斜面接種子瓶，用于發(fā)酵車間125m3發(fā)酵罐生產(chǎn)，其平均發(fā)酵水平比車間正常生產(chǎn)水平提高了接近15%（見(jiàn)圖1）。

圖1 篩選菌株與車間正常使用菌株發(fā)酵生產(chǎn)能力比較（μg/mL）

從圖1 可知，在發(fā)酵罐生產(chǎn)中，高產(chǎn)菌株與出發(fā)菌株的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程前期產(chǎn)量趨勢(shì)基本一致，中后期以后發(fā)酵能力比原始菌株的優(yōu)勢(shì)開(kāi)始顯現(xiàn)，平均放罐效價(jià)達(dá)到47684u/mL，比對(duì)照菌株的發(fā)酵效價(jià)提高了14.7%。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明了篩選菌株在發(fā)酵能力上穩(wěn)定可靠，可以作為車間生產(chǎn)菌種使用。

3 結(jié)果與討論

紫外誘變和化學(xué)誘變作為促進(jìn)微生物基因突變的一種傳統(tǒng)方法，至今仍是工業(yè)微生物育種的重要手段，對(duì)微生物發(fā)酵行業(yè)的發(fā)展突破起到了積極作用。有大量報(bào)道稱抗生素抗性基因可能與抗生素結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因存在著一定的聯(lián)系[10]，抗生素產(chǎn)生菌中的抗性基因與抗生素合成的結(jié)構(gòu)基因緊密連鎖，可發(fā)生共突變，即抗性突變總是伴隨著產(chǎn)量突變[11]。

本試驗(yàn)以MON17042 為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線—氯化鋰雙重復(fù)合誘變處理，經(jīng)過(guò)瓊脂塊初篩和搖瓶復(fù)篩，獲得3 支高產(chǎn)突變菌株，平均搖瓶效價(jià)較對(duì)照提高37.6%。對(duì)篩選的菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，所篩選的高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，多次傳代后仍能保持較高的代謝能力。用于發(fā)酵車間大生產(chǎn)后，其實(shí)際表現(xiàn)與搖瓶表現(xiàn)基本一致，證明生產(chǎn)能力穩(wěn)定可靠，可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。