骨貝類制劑對豚鼠消化性潰瘍的療效及對胃黏膜表皮生長因子及其受體的影響*

李富琴，石永新△，彭光耀，徐 舒，田學武

(1.中國科學院大學深圳醫院，廣東 深圳 518106；2.南華大學附屬第一醫院，湖南 衡陽 421001)

隨著生活水平的提高及生活工作壓力的增加，消化性潰瘍發生率越來越高，且消化性潰瘍復發率也較高[1]。目前，消化性潰瘍的治療主要為質子泵抑制劑、中和胃酸藥物、抗幽門螺桿菌藥物和胃黏膜保護劑等傳統藥物的聯合治療[2]；但這種傳統藥物治療并沒有降低消化性潰瘍發病率和復發率。中醫在消化性潰瘍治療方面具有獨特優勢，骨貝類制劑治療消化性潰瘍在民間較為流傳，但關于骨貝類制劑治療消化性潰瘍的研究不多。表皮生長因子(EGF)在消化性潰瘍的愈合中發揮著重要作用[3]；EGF通過與其受體(EGFR)結合產生持續分裂信號，導致細胞分化增殖，從而促進消化性潰瘍的愈合[4]。本研究采用新的工藝制備了骨貝類制劑，研究了骨貝類制劑對胃潰瘍模型豚鼠胃潰瘍的療效及對EGF、EGFR表達的影響，探討了骨貝類制劑治療消化性潰瘍的可能機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 2019年1月選取豚鼠80只，英國種，雌雄各半，普通級，短毛，體重150～210 g，購自南華大學動物實驗室。豚鼠飼養條件：濕度50%～60%，溫度20～25 ℃，光照明暗各12 h，自由飲水、進食，分籠喂養。

1.1.2主要試劑和儀器 伊紅-蘇木素(HE)染色液購自安徽雷根生物技術有限公司，兔抗鼠EGF多克隆抗體、兔抗鼠EGFR多克隆抗體、生物素標記抗體、二氨基聯苯胺顯色試劑盒均購自美國Sigma公司，奧美拉唑腸溶膠囊為汕頭經濟特區鮀濱制藥廠產品(國藥準字：H10980308)，阿莫西林膠囊為山西同達藥業有限公司產品(國藥準字：H14033222)，水楊酸晶體為上海源葉生物科技有限公司產品(批號：H31A10B96366)，BI-2000醫學圖像分析系統購自成都泰盟電子有限公司，動物醫療內窺鏡系統VET-9000購自上海金旭醫療設備有限公司，病理切片及高倍電鏡為南華大學病理實驗室有償使用。

1.2方法

1.2.1建立胃潰瘍動物模型 將80只豚鼠取20只作為對照組，剩余60只建立胃潰瘍動物模型，具體方法：將豚鼠禁食24 h，然后每天每只豚鼠給予100 mg/kg水楊酸拌入飼料中喂養，每天3次，并給予驚嚇及冷熱刺激等不良刺激，觀察豚鼠飲食及飲水情況、活動量及精神狀態情況，7 d進行電子胃鏡觀察建模情況，對建模沒有成功的豚鼠繼續上述方法至建模成功。對照組豚鼠每天正常飼養,不給于不良刺激處理。

1.2.2制備骨貝類制劑 根據民間配方取豬股骨和牡蠣按1∶1比例磨粉制備骨貝類制劑。

1.2.3豚鼠分組及處理 將60只建模豚鼠隨機分為安慰劑組、抑酸組和骨貝類組，每組20只。于建模15 d開始，對照組、安慰劑組豚鼠每天給予淀粉20 g灌胃，抑酸組豚鼠每天給予奧美拉唑1.5 g/kg、每天3次灌胃，骨貝類組豚鼠每天給予骨貝類制劑1.5 g/kg、每天3次灌胃(劑量根據民間配方，成人劑量0.3 g/kg轉換為動物劑量，轉換公式參照文獻[5])，共灌胃14 d。每天觀察各組豚鼠飲食情況、活動量、情緒變化等。

1.2.4測定胃黏膜損傷情況 灌胃14 d后處死各組豚鼠，取胃組織，置于冰上，剪開胃大彎，用游標卡尺測定胃潰瘍最大橫經和縱經，計算胃潰瘍面積，并采用顯微鏡觀察胃黏膜肌層缺損寬度。計算胃潰瘍指數，斑點糜爛計1分，糜爛長度小于1 mm計2分，糜爛長度1～2 mm計3分，糜爛長度2～4 mm計4分，糜爛長度大于4 mm計5分。糜爛寬度大于1 mm時分值×2。糜爛分值之和為潰瘍指數。測定胃黏膜損傷情況后迅速將胃黏膜組織放入多聚甲醛中固定，用于HE、免疫組織化學(免疫組化)染色測定。

1.2.5HE染色測定胃黏膜組織病理形態學變化 將固定后的各組豚鼠胃黏膜組織進行脫水、透明、石蠟包埋，冠狀連續切成厚5 μm切片，選擇有胃潰瘍的切片進行HE染色，將石蠟切片經脫蠟入水后蘇木素染色10 min，鹽酸乙醇分色30 s，伊紅染色10 min，乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察胃黏膜病理形態學變化。

1.2.6免疫組化染色測定胃黏膜EGF、EGFR表達 將各組豚鼠含胃潰瘍的石蠟切片經二甲苯脫蠟、乙醇入水，加入過氧化氫孵育10 min，微波修復抗原，牛血清白蛋白孵育15 min，加入一抗∶兔抗鼠EGF抗體(1∶200)、兔抗鼠EGFR抗體(1∶200)過夜孵育，加入羊抗兔免疫球蛋白G孵育1 h，加入鏈霉親和素生物素辣根過氧化物酶復合物孵育60 min，二氨基聯苯胺顯色10 min，蘇木素復染，常規脫水、透明、封片。采用HPIAS-1000高清晰彩色圖像分析儀分析免疫組化染色圖片，計算EGF、EGFR光密度值。EGF、EGFR主要在胃黏膜頸部細胞的細胞質和壁細胞中表達，細胞中出現棕黃色顆粒者為陽性。

2 結 果

2.1各組豚鼠一般情況比較 各組豚鼠建模前攝食量、精神活動狀態均正常；建模各組豚鼠建模第3天攝食量逐漸下降，活動量持續減少，精神狀態逐漸變差，建模14 d攝食量不到正常豚鼠的1/2。建模15 d模型組豚鼠給予相應藥物處理后安慰劑組豚鼠攝食量、活動量仍繼續減少，精神狀態繼續變差，用藥14 d攝食量不足正常豚鼠的1/4；抑酸組、骨貝類組豚鼠從用藥7 d攝食量、活動量均逐漸增加，精神狀態逐漸好轉，用藥后14 d攝食量、活動量、精神狀態基本恢復至正常豚鼠水平。對照組豚鼠攝食量、活動、精神狀態一直處于正常狀態。

2.2各組豚鼠胃潰瘍情況比較 對照組豚鼠胃黏膜無潰瘍，建模各組豚鼠胃黏膜均有不同程度潰瘍。與安慰劑組比較，抑酸組、骨貝類組豚鼠胃潰瘍指數、潰瘍面積、黏膜肌層缺損寬度均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；抑酸組豚鼠胃潰瘍指數、潰瘍面積、黏膜肌層缺損寬度與骨貝類組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組豚鼠胃潰瘍情況比較

2.3各組豚鼠胃黏膜病理形態學比較 對照組豚鼠胃黏膜結構正常、腺體排列有序、無自發性潰瘍、無炎癥細胞浸潤；安慰劑組豚鼠建模8 d肌層纖維結構不清，出現大量壞死組織，潰瘍底部有瘢痕和肉芽組織形成等；抑酸組、骨貝類組豚鼠建模8 d肌層增厚，潰瘍底部有肉芽組織形成，潰瘍比較淺，炎癥細胞浸潤、潰瘍程度均較輕。見圖1。

圖1 各組豚鼠胃黏膜病理形態學比較(HE，200×)

2.4各組豚鼠胃黏膜EGF、EGFR表達情況比較 對照組豚鼠胃黏膜EGF、EGFR均弱陽性表達；抑酸組、骨貝類組豚鼠潰瘍旁胃黏膜EGF、EGFR表達均增強，骨貝類組豚鼠潰瘍旁胃黏膜中EGF表達較抑酸組強。與對照組比較，安慰劑組豚鼠潰瘍旁胃黏膜EGF、EGFR光密度值均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與安慰劑組比較，抑酸組、骨貝類組豚鼠潰瘍旁胃黏膜EGF、EGFR光密度值均明顯升高，且骨貝類組豚鼠潰瘍旁胃黏膜EGF、EGFR光密度值均明顯高于抑酸組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2、3，表2。

圖2 各組豚鼠胃黏膜EGF表達情況比較(免疫組化，400×)

圖3 各組豚鼠胃黏膜EGFR表達情況比較(免疫組化，400×)

表2 各組豚鼠胃黏膜EGF、EGFR光密度值比較

3 討 論

消化性潰瘍是臨床常見病之一，主要包括胃潰瘍和十二指腸潰瘍；胃潰瘍主要由胃酸分泌過多所致，幽門螺桿菌感染和非甾體抗炎藥物濫用也可引起胃黏膜防御功能下降，導致胃潰瘍的發生[6]。奧美拉唑在治療胃潰瘍中被廣泛應用，其為質子泵抑制劑，可有效抑制胃酸分泌，保護胃黏膜，緩解病情，在臨床治療胃潰瘍中效果顯著[7]。本研究通過水楊酸和冷熱、驚嚇刺激建立豚鼠胃潰瘍模型，并給予奧美拉唑治療，證實奧美拉唑對胃潰瘍豚鼠療效顯著。

西藥治療胃潰瘍可促進潰瘍愈合，防止復發，但西藥應用費用較高，療程較常，且長期服用抗生素易導致腸道菌群失調，增加幽門螺桿菌對抗菌藥物的耐藥性[8-10]。

中國傳統醫學的中醫具有5 000多年歷史，在消化性潰瘍治療方面取得了巨大成果。民間骨貝類制劑常采用豬股骨、牡蠣等，來源廣泛，費用低廉，在藥物資料、經濟條件和信息交流較匱乏的古代，在民間治療消化性潰瘍中廣為流傳，并取得了良好效果。但關于骨貝類制劑治療消化性潰瘍的研究不多，作者曾于2009年就骨貝類對豚鼠胃潰瘍的治療作用進行了研究，結果顯示，骨貝類在治療胃潰瘍中效果顯著，可促進潰瘍面修復和愈合[11]。但進行上述研究時作者尚處于學生階段，對消化性潰瘍的認識及科研方法不是十分成熟，并且未對其可能的作用機制進行研究。本研究采用水楊酸和冷熱、驚嚇刺激等建立胃潰瘍模型，采用動物電子胃鏡評價建模是否成功，將胃潰瘍模型豚鼠給予骨貝類制劑治療，觀察了其療效及可能的作用機制，結果顯示，骨貝類制劑可有效降低胃潰瘍指數、潰瘍面積、黏膜肌層缺損寬度，其對胃潰瘍指數、潰瘍面積、黏膜肌層缺損寬度的降低程度雖稍低于奧美拉唑組，但差異無統計學意義(P>0.05)。表明骨貝類制劑對胃潰瘍的療效與奧美拉唑相當。

為探討骨貝類制劑對胃潰瘍可能的作用機制，本研究探討了骨貝類制劑、奧美拉唑對胃潰瘍EGF、EGFR表達情況的影響，結果顯示，對照組豚鼠胃黏膜EGF、EGFR均弱陽性表達，安慰劑組豚鼠潰瘍旁胃黏膜EGF、EGFR均表達增強，抑酸組、骨貝類組豚鼠潰瘍旁胃黏膜EGF、EGFR表達均較安慰劑組增強，骨貝類組豚鼠潰瘍旁胃黏膜EGF、EGFR表達均強于抑酸組。

胃潰瘍愈合是一種復雜的過程，涉及肉芽組織生長、壞死組織清除、新生血管生成、瘢痕組織和纖維組織形成、上皮重構等多種過程。與細胞分化、增殖、移行、新生血管生成、細胞外基質形成有關的多種細胞生長因子參與胃潰瘍的愈合過程。EGF是參與胃潰瘍預后的重要生長因子，具有抑制壁細胞分泌胃酸、維持胃黏膜完整性、促進胃黏膜細胞DNA、RNA和蛋白質合成等多種作用，是一種重要的胃黏膜保護因子，但EGF必須與胃黏膜細胞上的EGFR結合而發揮作用[12-13]。EGFR具有減少胃酸分泌、促進胃黏膜增殖、修復等重要功能，對EGF具有高度親和力和特異性，當EGF到達靶細胞表面時可快速與細胞上的EGFR結合而發揮生物學功能[14-15]。正常胃黏膜只有少量EGFR表達，胃潰瘍時EGFR表達增加，隨著胃潰瘍的愈合EGFR表達不斷增加；EGFR通過表達增加促進胃黏膜增殖，增加黏膜厚度，加速潰瘍重新上皮化，從而促進潰瘍愈合，并提高潰瘍愈合質量[16-18]。因此，分析骨貝類制劑保護胃潰瘍可能的作用機制為骨貝類制劑具有促進潰瘍旁胃黏膜EGF、EGFR表達的作用；骨貝類制劑對潰瘍旁胃黏膜中EGF、EGFR表達的促進作用高于奧美拉唑，表明骨貝類制劑對胃潰瘍的愈合質量高于奧美拉唑。

綜上所述，骨貝類制劑治療胃潰瘍療效顯著，可能通過促進EGF、EGFR的表達而促進胃潰瘍愈合，其治療胃潰瘍的療效與奧美拉唑相當，但對胃潰瘍的愈合質量可能高于奧美拉唑。