海參肽提高免疫力的功效評(píng)價(jià)

◎樂(lè)卿清，廖翼江，湯桂秋，楊隆河，陳婷婷，陳思謹(jǐn)，蔡 兵

（1.自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門(mén) 361005；2.肽能九號(hào)生物科技有限公司，福建 廈門(mén) 361101）

免疫系統(tǒng)可促進(jìn)特異性免疫和非特異性免疫功能，淋巴細(xì)胞是特異性免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞群。胸腺屬中央淋巴器官，主要功能是確保T 淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生和成熟，脾臟對(duì)抗原發(fā)生免疫應(yīng)答作用。因此淋巴細(xì)胞的增殖及淋巴器官的增重都是評(píng)價(jià)免疫系統(tǒng)的常見(jiàn)方法。巨噬細(xì)胞是機(jī)體非特異免疫系統(tǒng)的部分，在機(jī)體固有和適應(yīng)性免疫功能中扮演著重要的角色，具有吞噬、殺傷、抗原遞呈、分泌生物活性物質(zhì)和調(diào)控機(jī)體免疫等多種功能。

海參是“海八珍”之首，深受人們的喜愛(ài)，也是常用的饋贈(zèng)禮品。近幾年來(lái)對(duì)海參肽研究報(bào)道非常多，其具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和保健功能[1-3]，如可以提高免疫力、抗疲勞、抗腫瘤和延緩衰老等。本實(shí)驗(yàn)采取小鼠脾細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)、小鼠巨噬細(xì)胞吞噬中性紅實(shí)驗(yàn)、免疫力低下模型小鼠的淋巴器官增重實(shí)驗(yàn)探討海參肽的生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海參肽，由肽能九號(hào)生物科技有限公司提供；細(xì)胞色素C、抑肽酶、桿菌肽、甘氨酸三聚體、甘氨酸對(duì)照品、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（AAS18）、脂多糖（LPS）和ConA，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；胎牛血清（Hyclone）；1640-RPMIMedium（GIBCO）；PBS緩沖液、HanK’s 液、CKK8 和檸檬酸三鈉，北京索來(lái)寶科技有限公司；地塞米松磷酸鈉，羅恩試劑公司；Balb/c 種小鼠（SPF 級(jí)），18～20 g，雄性，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AKTA pure 蛋白層析儀，美國(guó)GE 公司；Dionex ICS 3000 離子色譜儀，美國(guó)Dionex 公司，包括帶有在線脫氣裝置的四元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱；Chiomeleon 6.80 色譜工作站；STERI-CYCLE 二氧化碳培養(yǎng)箱、MEGAFGE 11R Centrifuge 離心機(jī)，美國(guó)Thermo 公司；Mithras2 LB943 酶標(biāo)儀，德國(guó)Berthold公司；SW-CJ-1D 超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；蔡司Axio Imager A2 正置光學(xué)顯微鏡，德國(guó)Carl Zeiss AG 公司；AL204 萬(wàn)分之一分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SQP 十萬(wàn)分之一分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；GR60DA 高壓滅菌鍋，美國(guó)Zealway 公司；Milli-Q Reference 超純水系統(tǒng)，美國(guó)密理博公司。

1.3 分子量的測(cè)定

1.3.1 色譜條件

色譜柱：SuperdexTM30 Increase 10/300 GL 凝膠柱；色譜條件：流動(dòng)相：50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液+280 mmol·L-1NaCl+10 mmol·L-1KCl； 流 速：0.5 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2 對(duì)照品與樣品的配制

精密稱取對(duì)照品適量，置于100 mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，配制成每1 mL 含細(xì)胞色素C 5 mg、抑肽酶5 mg、桿菌肽5 mg、甘氨酸三聚體5 mg和甘氨酸20 mg 的對(duì)照品溶液；精密稱取海參肽適量，置于100 mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，配制成每1 mL 含海參肽5 mg 的溶液。

1.4 海參肽中氨基酸的組成與含量

1.4.1 色譜條件

氨基酸分析柱（AminoPac PA-10，2 mm×250 mm）；氨基酸保護(hù)柱（AminoPac PA-10，2 mm×50 mm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A 為去離子水，流動(dòng)相B 為250 mmol·L-1NaOH 溶液，流動(dòng)相C 為1.0 mmol·L-1NaOAc，進(jìn)行梯度洗脫，流速0.25 mL·min-1，積分脈沖安培檢測(cè)器，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量為25 μL。

1.4.2 樣品的配制

精密稱取海參肽樣品100 mg 置于消解管中，加入6 mol·L-1鹽酸溶液10 mL 于110 ℃下加熱水解24 h，放冷轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，精密吸取1 mL 至100 mL 的容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得。

1.5 海參肽對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)巨噬細(xì)胞（Raw264.7），調(diào)整細(xì)胞濃度，將其接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使得細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/孔，然后加入不同濃度海參肽（n=6）。以不加藥組為對(duì)照。培養(yǎng)24 h 后吸去培養(yǎng)基，用PBS 洗滌多余的培養(yǎng)基，加入0.33%中性紅，37 ℃下，5% CO2孵育30 min，PBS 洗凈多余中性紅，加細(xì)胞裂解液（無(wú)水乙醇∶冰醋酸＝1∶1，體積比），震蕩10～15 mim 后，在酶標(biāo)儀上540 nm 處測(cè)吸光度值，通過(guò)吸光值的大小評(píng)價(jià)樣品促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力。

1.6 海參肽對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響

將小鼠脫頸處死，立即置于75%酒精中浸泡5 min，無(wú)菌取脾，于PBS 中清洗2 遍，置于盛有4 ℃預(yù)冷PBS 的200 目細(xì)胞篩中，用5 mL 注射器內(nèi)芯研磨，研磨后透過(guò)細(xì)胞篩的即為脾細(xì)胞懸液。于1 500 r·min-1，4 ℃離心5 min，棄上清；加入3 mL Tris-NH4Cl 溶液混勻，于1 500 r·min-1，4 ℃離心5 min，棄上清，加入1640RPMI-FBS 液重懸細(xì)胞，稍靜置，轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管，以4×106～5×106個(gè)/mL 200 μL/孔鋪96 孔板，2 h 后加入海參肽及陽(yáng)性藥ConA 和LPS 處理，46 h 后，以1∶10 的比例加入CCK8（20 μL/200 μL），2h 后檢測(cè)450 nm 吸光度，620 nm 為參比波長(zhǎng)。

1.7 海參肽對(duì)地塞米松誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

同1.6 方法無(wú)菌取健康小鼠脾淋巴細(xì)胞。分別加入地塞米松（終濃度為10 μmmol·L-1）、海參肽（終濃度為10μg·mL-1）或兩者共同培養(yǎng)，對(duì)照組加PBS。比較海參肽對(duì)地塞米松誘導(dǎo)脾細(xì)胞死亡的影響。

1.8 小鼠免疫器官增重實(shí)驗(yàn)

體內(nèi)給藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用Balb/C 小鼠（雄性，SPF級(jí)），每組10 只動(dòng)物，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d 后，分成5 組：正常對(duì)照組、免疫低下模型組、海參肽低、中及高劑量組（100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、400 mg·kg-1）；免疫低下模型組采用隔日腹腔注射地塞米松，40 mg·kg-1·d-1，連續(xù)10 次，建立小鼠免疫低下模型，正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水。首次腹腔注射地塞米松次日，開(kāi)始灌胃給海參肽，給藥21 d，正常組、模型組給予同體積的水。給藥結(jié)束后，稱小鼠體重，取胸腺及脾稱重，計(jì)算胸腺及脾臟指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子量的測(cè)定

通過(guò)與對(duì)照品出峰時(shí)間比較，經(jīng)過(guò)計(jì)算，海參肽的主峰位置為12.63 mL；對(duì)應(yīng)的分子量為1 648 Da。其半峰位置為9.11 mL 和16 mL，對(duì)應(yīng)分子量為10 673 Da和276 Da。海參肽的凝膠色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 海參肽的凝膠色譜圖

2.2 海參肽中氨基酸的組成與含量測(cè)定

氨基酸含量測(cè)定結(jié)果顯示肽能九號(hào)生物科技有限公司制備的海參肽含有的氨基酸種類(lèi)達(dá)到16 種，其中甘氨酸含量最高，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 海參肽的氨基酸含量結(jié)果表

2.3 海參肽對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

海參肽對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響結(jié)果見(jiàn)表2，從表中可以看出，海參肽在低中高3 個(gè)濃度（1～100 μg·mL-1）下，具有顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力，并且具有劑量依賴性，活性比陽(yáng)性藥LPS 強(qiáng)。

表2 海參肽對(duì)巨噬細(xì)胞Raw264.7 吞噬中性紅能力的影響表

2.4 海參肽對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響

表3、表4 的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，海參肽單獨(dú)給藥對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖無(wú)影響，和絲裂原LPS 及ConA 有協(xié)同作用，刺激了小鼠淋巴細(xì)胞增殖，與LPS 或ConA相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 海參肽對(duì)B 淋巴細(xì)胞增殖的影響表

表4 海參肽對(duì)T 淋巴細(xì)胞增殖的影響表

2.5 海參肽對(duì)地塞米松誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

表5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，地塞米松能誘導(dǎo)脾細(xì)胞的死亡，而海參肽能顯著保護(hù)地塞米松誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

表5 海參肽對(duì)地塞米松誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞死亡的保護(hù)作用表

2.6 小鼠免疫器官增重實(shí)驗(yàn)

表6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，海參肽在中高兩個(gè)濃度（200 mg·kg-1、400 mg·kg-1）下，增加了免疫力低下小鼠的胸腺重量，并且具有劑量依賴性。高劑量的海參肽也增加了免疫力低下小鼠的脾臟的重量。

表6 海參肽對(duì)小鼠免疫器官的影響表（n=10）

3 結(jié)論

氨基酸含量分析表明，肽能九號(hào)生物科技有限公司制備的海參肽氨基酸種類(lèi)豐富，含量充足，甘氨酸含量達(dá)到29.71%。有關(guān)海參肽的氨基酸含量與功能的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

采用ConA、LPS 刺激淋巴細(xì)胞的增殖是細(xì)胞水平評(píng)價(jià)樣品對(duì)免疫力影響的經(jīng)典方法[4]。本文采用了肽能九號(hào)公司提供的海參肽樣品，首先對(duì)LPS 和ConA 誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞（B 細(xì)胞或T 細(xì)胞）增殖活性進(jìn)行了探討，結(jié)果表明海參肽有提高淋巴細(xì)胞增殖的作用。

地塞米松是臨床上常用的免疫抑制劑，對(duì)免疫反應(yīng)的多個(gè)環(huán)節(jié)有抑制作用[5]。本實(shí)驗(yàn)采用地塞米松誘導(dǎo)，建立細(xì)胞及小鼠免疫抑制模型。給予地塞米松后，其細(xì)胞數(shù)量減少，動(dòng)物的體重、胸腺及脾臟指數(shù)均顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肽能九號(hào)生物科技有限公司自提的海參肽對(duì)地塞米松誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡有保護(hù)作用，對(duì)免疫低下小鼠的胸腺和脾臟有增重的作用。研究提示海參肽可以通過(guò)對(duì)T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞的增殖來(lái)提高免疫力低下小鼠的免疫功能。

市場(chǎng)上海參肽的復(fù)方很多[6-7]，提示肽能九號(hào)生物科技有限公司自提的海參肽可以和其他提高免疫力的食品復(fù)配，在滿足提高免疫力功能的同時(shí)，改善口感和風(fēng)味，有一定的升值空間。