雜豆芽菜多酚類物質及抗氧化活性研究

◎李 慧，劉 義，魏 林，徐 斌，任勰珂，劉向前，張先果

（1.貴州食品工程職業(yè)學院，貴州 貴陽 551400；2.貴州中儲糧糧油質監(jiān)中心，貴州 貴陽 550009；3.中央儲備糧貴陽直屬庫有限公司，貴州 貴陽 550009；4.中國儲備糧管理集團有限公司貴州分公司，貴州 貴陽 550009）

芽菜是一種新型蔬菜，其采用無土栽培技術，具有無污染、無公害等特點[1]，是人們餐桌上常見的一道美食，性味甘平，有健脾、潤燥、排毒、消腫止痛、清熱利濕和抗癌的作用[2-3]。經研究發(fā)現，芽菜中含有大量的酚類化合物，包括酚酸、黃酮類化合物和花色苷等，這些酚類化合物都有很強的抗氧化活性。目前，有證據表明，多酚化合物在預防與人類年齡相關的疾病方面有十分明顯的功效，如預防心腦血管疾病、癌癥等[4-5]。關于植物多酚的生物活性方面的研究也已經十分廣泛和深入，植物多酚對人類健康方面的獨特作用已經得到人們的普遍認可。本文選用綠豆、紅豆、蕓豆3 種雜豆進行培育，研究其芽菜的酚類物質及抗氧化活性，為后續(xù)芽菜的原料選擇、市場開發(fā)、精深加工等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

綠豆、紅豆、蕓豆，均為當年新豆，購于貴州省大方縣。

1.1.2 試劑

沒食子酸、福林酚、碳酸鈉、蘆丁、亞硝酸鈉、六水氯化鋁、氫氧化鈉、甲醇、無水乙醇、Trolox、DPPH（1，1-二苯-2-苦肼基）、TPTZ（三吡啶三吖嗪）、醋酸鈉、冰醋酸、濃鹽酸和氯化鐵，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FW100 型高速萬能粉碎機，天津泰斯特；TD5A 型多管架式離心機，長沙英森儀器有限公司；722 型可見光分光光度計，上海精密儀器有限公司；AR-2140 型電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海分心實驗儀器有限公司；DGG-9053 型電熱恒溫鼓風干燥箱，海森信實驗儀器有限公司。

1.3 樣品制備

1.3.1 豆類種子原料的選擇

選擇適量色澤新鮮、籽粒飽滿、無蟲蛀、無霉爛、無殘破、發(fā)芽勢強的優(yōu)質豆類種子備用。

1.3.2 試驗用芽菜的培養(yǎng)

將選取的豆類種子清洗2～3 遍后浸泡24 h，進行芽菜制備（25～28 ℃、遮光、每隔12 h 淋水1 次）。每12 h取樣1次，先測濕重，于烘箱中烘干（38～42 ℃）測干重，再將烘干的芽菜樣品粉碎成質地均勻的粉末，放入自封袋中密封保存并做好相應的標記，在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 芽菜酚類化合物的提取

取芽菜樣品0.5 g，按料液比為1∶15 加入50%乙醇，30 ℃避光水浴浸提，每15 min 手動振搖1 次，1.5 h后避光靜置8 min 后3 500 r·min-1離心15 min。將殘渣加7.5 mL 50%乙醇2 次浸提，將提取液與第1 次提取液混合，避光冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實驗方法

1.4.1 總酚含量的測定

參考SINGLETON 方法[6]并略做修改，以沒食子酸作為標準品制作標準曲線，曲線方程為Y=2.108 1X+0.015 2，相關系數R2=0.999 2，吸取100 μL樣液至5 mL 容量瓶中，加入3 mL 蒸餾水，混合后加入250 μL 福林酚試劑，再加入750 μL 20%的碳酸鈉溶液，蒸餾水定容，置于40 ℃避光水浴反應30 min。在760 nm 波長處測定吸光度值。空白以100 μL 蒸餾水代替。以沒食子酸計，最后結果表示為沒食子酸當量（mg GAE/100 g DW）。

1.4.2 類黃酮含量的測定

參考DEWANTO[7]方法進行測定，以蘆丁作為標準品制作標準曲線，曲線方程為Y=8.835 7X+0.015 7，相關系數R2=0.999 2。樣品中類黃酮含量以蘆丁計，最后結果表示為蘆丁當量（mg RAE/100 g DW）。

1.4.3 DPPH 自由基清除能力的測定

根據BRAND WILLIAM 等[8]的方法并略做修改，以Trolox 作為標準品制作標準曲線，曲線方程為Y=0.062 0X+1.582 7，相關系數R2=0.999 1。分別取7.8 mL DPPH 甲醇液和200 μL 樣液（其中蕓豆芽菜提取液取200 μL 經50%乙醇稀釋后再取200 μL）先后加入10 mL 棕色容量瓶中，混勻。于室溫暗處反應60 min后在515 nm處測定殘留DPPH自由基吸光度。對照組設置為200 μL 空白提取液代替樣液。平行做3 組，取平均值。樣液或已知濃度的Trolox 標準液對DPPH 自由基的抑制率按公式（1）計算：

式（1）中：A0是對照組在515 nm 處吸光度；A是反應液終止時515 nm 處吸光度。

樣品的自由基清除能力根據它們的抑制率表示為Trolox 當量（mmol/L TE/100 g DW）。

1.4.4 FRAP 法測定粗提物的總抗氧化能力

參照BENZIE[9]等的方法并略做修改，以Trolox 作為標準品制作標準曲線，曲線方程為Y=0.001 2X+0.018 8，相關系數R2=0.999 5。吸取200 μL 樣液于10 mL 容量瓶中，再加入600 μL蒸餾水，混勻，最后加入6 000 μL現配好的FRAP 工作液，混勻。將混勻的溶液置于恒溫水浴鍋中37 ℃反應30 min 后于595 nm 處測定產物的吸光度值。對照組設置為200 μL 提取液代替樣液。樣品的氧化還原能力表示為Trolox 當量（mmol/L TE/100 g DW）。

1.5 數據分析

采用Origin 8.6 軟件繪制圖表，SPSS 21.0 軟件進行Pearson 相關性分析。

2 結果與討論

2.1 芽菜生長過程中酚類化合物含量變化

2.1.1 綠豆芽菜多酚類物質含量變化

綠豆芽菜生長過程中酚類化合物含量測定結果見圖1 和圖2。從總體上看，綠豆芽菜在生長過程中總酚、類黃酮含量呈現先下降后上升的趨勢。在總酚方面，綠豆種子的含量為363.024 mg GAE/100 g DW。然后培養(yǎng)至0～12 h 時有一個下降的過程，下降到最低為221.005 mg GAE/100 g DW。而后又逐漸升高，在培養(yǎng)至84 h 后，綠豆小明綠芽菜總酚含量升高趨勢明顯，在第120 h 達到最高值為815.853 mg GAE/100 g DW，為豆類種子的2.25 倍；綠豆種子類黃酮含量為30.320 mg RAE/100 g DW。然后培養(yǎng)至0～12 h 時含量下降到最低為15.381 mg RAE/100 g DW，而后含量又開始上升，在培養(yǎng)至60 h 后，綠豆芽菜類黃酮含量升高趨勢逐漸明顯，120 h 達到最高值為56.294 mg RAE/100 g DW，為豆類種子的1.86 倍。

圖1 綠豆芽菜生長過程中總酚物質含量圖

圖2 綠豆芽菜生長過程中類黃酮物質含量圖

2.1.2 紅豆芽菜多酚類物質含量變化

紅豆芽菜生長過程中酚類化合物含量測定結果見圖3 和圖4。紅豆芽菜生長過程中，種子的總酚含量為532.660 mg GAE/100 g DW。生長過程中基本呈上升的趨勢，培養(yǎng)至132 h 后其總酚含量開始高于種子，最后12 h 升高的最明顯，在第144 h 達到最高值為704.141 mg GAE/100 g DW，為豆類種子的1.32 倍；紅豆種子的類黃酮含量為104.338 mg RAE/100 g DW。也是整個培養(yǎng)過程的最大值。生長過程中基本呈現先下降后趨于穩(wěn)定的現象。其中，培養(yǎng)至0～12 h 含量緩慢下降最快至含量為36.941 mg RAE/100 g DW。繼續(xù)培養(yǎng)至48～144 h含量變化范圍很小，僅在0～3.056 mg RAE/100 g DW，紅豆芽菜的類黃酮含量顯著低于種子。

圖3 紅豆芽菜生長過程中總酚含量圖

圖4 紅豆芽菜生長過程中類黃酮含量圖

2.1.3 蕓豆豆芽菜多酚類物質含量變化

蕓豆芽菜生長過程中酚類化合物的含量變化見圖5 和圖6。在蕓豆芽菜生長過程中，種子的總酚含量為534.083 mg GAE/100 g DW。生長過程中基本呈先下降后上升到最大值后又開始下降的趨勢，培養(yǎng)至60～132 h時其含量升高趨勢明顯，培養(yǎng)至120～132 h 時升高的最明顯，在第132 h 達到最高值為921.873 mg GAE/100 g DW，為豆類種子的1.726 倍；蕓豆在生長過程中，種子的類黃酮含量為78.194 mg RAE/100 g DW，基本呈現先緩慢降低再逐漸升高的趨勢，培養(yǎng)至12～84 h含量緩慢下降至最低為20.134 mg RAE/100 g DW。培養(yǎng)至84～132 h 時含量開始上升，培養(yǎng)至132～144 h 含量又出現下降。其中，培養(yǎng)至84～96 h 上升最快，培養(yǎng)至132 h 達到最高值為47.467 mg RAE/100 g DW，低于種子含量。

圖5 蕓豆芽菜生長過程中總酚含量圖

圖6 蕓豆芽菜生長過程中類黃酮含量圖

2.2 芽菜抗氧化活性變化

2.2.1 綠豆豆芽抗氧化活性變化

總體來看，綠豆芽菜在生長過程中DPPH 清除自由基能力和鐵離子還原能力均呈大幅上升趨勢見圖7。綠豆種子時期的DPPH清除自由基能力為0.902 mmol/L TE/100 g DW，在0～12 h 有所下降后一直呈現上升趨勢，在120 h DPPH 清除自由基能力達到最高值為2.715 mmol/L TE/100 g DW，為種子的2.77 倍；綠豆種子的鐵離子還原能力為1.153 mmol/L TE/100 g DW，在0～12 h 有所下降后又明顯上升，在120 h 鐵離子還原能力達到最高值為3.421 mmol/L TE/100 g DW，為種子的2.98 倍。

圖7 綠豆芽菜生長過程中的DPPH 清除自由基能力和鐵離子還原能力圖

2.2.2 紅豆豆芽抗氧化活性變化

紅豆在生長過程中DPPH 清除自由基能力和鐵離子還原能力均呈上升趨勢見圖8。種子時期的DPPH清除自由基能力為2.202 mmol/L TE/100 g DW，而后呈先下降后上升變化趨勢。在最后12 h 升高得最明顯，在144 h DPPH 清除自由基能力達到最高值為2.543 mmol/L TE/100 g DW，為豆類種子的1.15 倍；紅豆種子的鐵離子還原能力為2.493 mmol/L TE/100 g DW，在0～12 h 有一個大幅下降的過程，約下降了1.121 mmol/L TE/100 g DW。而后繼續(xù)呈現上升的趨勢，144 h 鐵離子還原能力達到最高值為3.264 mmol/L TE/100 g DW，為豆類種子的1.31 倍。

圖8 紅豆芽菜生長過程中的DPPH 清除自由基能力和鐵離子還原能力圖

2.2.3 蕓豆芽抗氧化活性變化

蕓豆芽菜在生長過程中DPPH 清除自由基能力和鐵離子還原能力均呈現先下降后上升的趨勢見圖9。蕓豆種子DPPH 清除自由基能力為2.308 mmol/L TE/100 g DW，在0～36 h 呈下降趨勢，且在36 h 為最低值1.123 mmol/L TE/100 g DW，在36～144 h 呈現上升趨勢，在96～120 h 升高得最明顯，在144 h DPPH 清除自由基能力達到最高值為2.731 mmol/L TE/100 g DW，為豆類種子的1.18 倍；蕓豆種子的鐵離子還原能力為2.286 mmol/L TE/100 g DW，在0～36 h 呈現下降趨勢，鐵離子還原能力下降1.031 mmol/L TE/100 gDW，在36～60 h 鐵離子還原能力變化不明顯，在72～108 h 呈現上升趨勢，在108～120 h 鐵離子還原能力變化不明顯，而后繼續(xù)上升，在132～144 h又有所下降。在120～13 2h 升高得最明顯，在132 h 鐵離子還原能力達到最高值為2.677mmol/L TE/100 g DW，為豆類種子的1.17 倍。

圖9 蕓豆芽菜生長過程中的DPPH 清除自由基能力和鐵離子還原能力圖

芽菜生長過程中DPPH 自由基清除能力與鐵離子還原能力有相同的趨勢，具有一定的相關性，這與陳玉霞等的研究一致[10]。3 種豆子在萌發(fā)過程中，多酚類物質含量與抗氧化活性變化比較相似，這與梁雅芹[11]等研究的結果相似。查閱文獻發(fā)現，抗氧化活力的增強可能是由于酶激活作用，且雜豆中抗氧化成分比較多，除多酚物質外，還存在水溶性維生素E、維生素C 等抗氧化成分，這些物質也會在萌發(fā)過程中被激發(fā)出來。

3 結論

3 種雜豆芽菜中，酚類物質均出現升高的現象，其中蕓豆芽菜總酚含量最高，為921.873 mg GAE/100 g DW；綠豆芽菜類黃酮含量在生長過程中有所升高，最終升至56.294 mg RAE/100 g DW，紅豆、蕓豆芽菜類黃酮含量均呈現下降趨勢，且含量均低于綠豆。

在3 種雜豆芽菜酚類物質的DPPH 清除自由基能力和鐵離子還原能力的測定中，蕓豆芽菜的平均DPPH 清除自由基能力最強，綠豆芽菜的鐵離子還原能力最強。

綠豆、紅豆、蕓豆芽菜生長過程中酚類物質的DPPH清除自由基能力和鐵離子還原能力存在相關性，用SPSS 分析得出，3 種芽菜DPPH 清除自由基能力和鐵離子還原能力相關性系數分別為0.992**、0.948**和0.955**。