平板計數法檢測肉制品中單核增生李斯特氏菌的不確定度分析與評定

◎劉胤璇，王劍飛，楊蕊銀，何 磊，白秀珍

（紅河州質量技術監督綜合檢測中心，云南 蒙自 661199）

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytocytogenes，LM）是一種革蘭氏陽性桿狀細菌，簡稱單增李斯特菌。單增李斯特菌是引發食物中毒的重要病原菌[1-2]，菌株即使在低溫和酸性環境中也能夠生存[3]，且李斯特菌可在食物表面形成生物膜，導致食物交叉污染[4-5]。

測量不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性與測量結果相關聯的參數[6]，主要反映測量結果的可信程度，為測定結果的準確性分析提供技術支撐[7]，因此評定測量不確定度是衡量測量結果質量的重要指標[8]。本研究在肉制品中定量添加單增李斯特菌標準菌種，通過分析計算檢驗過程的不確定度，建立平板計數法測定肉制品中單核增生李斯特氏菌的不確定度評定方法，在具體檢測中提高科學性和準確性[7,9-10]。

1 材料和方法

1.1 樣品

以即食火腿腸為測試樣品，加入單增李斯特菌（編號ATCC19111，第2 代工作用菌種）菌懸液，用拍擊式均質器拍擊2 min 制備成1∶10 的樣品勻液。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

T500 電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）、PREVI Color Gram 全自動革蘭氏染色儀（法國梅里埃公司）、1 mL/10 mL 移液器（德國普蘭德公司）、BD115 培養箱（德國BINDER 公司）、HBM-400C 樣品均質器（天津恒奧科技發展有限公司）及數顯溫濕度計（德國testo 公司）。

1.2.2 試劑

LB 肉湯、李斯特氏菌顯色培養基、木糖、鼠李糖、TSA-YE 培養基、SIM 動力培養基、過氧化氫酶、單增李斯特氏菌干制生化鑒定試劑盒。以上試劑生產企業均為北京路橋技術股份公司。

1.3 檢驗方法

依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB 4789.30—2016）[11]第二法進行檢驗。在相同實驗條件下，兩名檢驗人員分別對相同的10 份樣品進行檢驗，合計進行20 次實驗。參照《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[6]、《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》（RB/T 151—2016）[12]對結果進行不確定度分析評定。

2 結果與分析

2.1 建立數學模型

選擇菌落數在15～150 CFU 的條件下建立數學模型（1）。

式（1）中，T-樣品中單核增生李斯特氏菌菌落數，單位為CFU·mL-1（g）；A-某一稀釋度典型菌落的總數，單位為CFU；B-某一稀釋度鑒定為陽性的菌落數，單位為CFU；C-某一稀釋度用于鑒定試驗的菌落數，單位為CFU；d-稀釋因子。

2.2 測量不確定度分析

依照“黑匣子”的方法，確定和分析單增李斯特氏菌不確定度的分量來源[7,9,12-16]，不確定度分量來源見圖1。

圖1 不確定度分量來源圖

2.3 不確定度分量的計算

2.3.1 稱量樣品引入的相對不確定度urel（Ws）

稱量樣品引入的不確定度來源：①天平校準的不確定度。T500 電子天平（d=0.1 g） 檢定證書最大允許誤差為±0.5 g，按矩形分布，。②天平可讀性引入的不確定度。天平最小有效數字為0.1 g，按矩形分布，。③天平稱量重復性引入的不確定度。電子天平檢定證書給出的重復性誤差為0，故u（WR3）=0。

2.3.2 制備樣品均液引入的相對不確定度urel（Vs）

制備樣品均液使用量筒量取225 mL 稀釋液，引入的不確定度來源：①溫度引起變化的不確定度u（Td）。實驗室溫度為21.5 ℃，與20 ℃相差1.5 ℃，水的膨脹系數為2.1×10-4/℃[7]，假設矩形分布，則。②量筒容量允差引入的不確定度。根據《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006）[17]規定，250 mL 量筒的容量允差分別為±2.0 mL，假設矩形分布，u（V1-1）=1.154 7 mL。③量筒分辨率的不確定度，225 mL 量筒分辨率為5 mL，假設三角分布，u（V1-2）=1.020 6 mL。

2.3.3 樣品10 倍稀釋引入的相對不確定度urel（X1）

樣品稀釋至1∶100，使用1 mL 移液器移取1 mL的1∶10 樣品均液至9 mL 稀釋液（使用10 mL 移液器移?。?，引入的不確定度來源：①溫度引起體積變化的不確定度u（Td2）。實驗室溫度21.5 ℃：

②移液器允差的不確定度u(VR2)。根據《移液器檢定規程》（JJG 646—2006）[18]規定，1 mL、10 mL 移液器容量允差分別為1.0%、0.6%。假設三角分布，1 mL移液器移取1 mL不確定度u(VR2-1mL)=0.004 1 mL，10 mL移液器移取9 mL 不確定度u(VR2-9mL)=0.022 0 mL。

綜合上述兩個不確定度，移液器引入的合成不確定度為：

相對不確定度：urel(V2-1mL)=0.004 1÷1=0.004 1，u(V2-9mL)=0.022 1÷9=0.002 5。因此，10 倍稀釋引入的相對不確定度urel(X1)=0.004 8。

2.3.4 樣品加樣體積引入的相對不確定度urel(X2)

1∶10、1∶100 兩個稀釋度分別用1 mL 移液器移取0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 三個平板，假設三角分布，相對不確定度分別為：0.004 1、0.004 1、0.004 1，合成單次不確定度為

兩次加樣引入的相對不確定度

2.3.5 重復試驗引入的相對不確定度urel(N)

由于重復實驗結果的數值偏離比較大，采用統計學對數的方法對其結果的數值進行不確定度計算，檢驗結果見表1、表2。重復試驗引入的相對不確定度來源：

表1 重復檢測單增李斯特氏菌含量表（單位：CFU·g-1）

表2 重復檢測單增李斯特氏菌含量對數結果表

①重復檢驗引入的不確定度，

②不同人員實驗組間變化引入的相對不確定度：

2.4 相對合成不確定度uc,rel

比較各不確定度分量，分析其產生的原因，計算相對合成不確定度

2.5 擴展不確定的u95rel

實驗中，取包含因子k=2，置信概率為95%，則樣品中單增李斯特菌含量對數的擴展不確定度u95rel=0.115 0。本次實驗測得單增李斯特菌含量對數均值為3.868 4，結果報告為103.8684±0.1150，即單增李斯特菌含量為5 700～9 600 CFU·g-1。

3 結論

食品安全問題是當今社會普遍關注的焦點，如何快速分析食品安全隱患及提高檢測準確度是解決食品安全問題的關鍵。測量不確定度是評價測量值可信度的重要參數。從本次實驗結果可以看出，樣品稱量、稀釋、加樣、重復實驗等都會對實驗結果準確度產生影響，其中占主要部分的是重復試驗引入的不確定度分量?？紤]到不同菌種均勻性、設備、培養基等對結果不確定度均會產生影響，建議對每種目標菌均進行不確定度評定；當更換設備、培養基時應重新對不確定度進行評定[9]。