基于SCoT 標記的飼用燕麥品種遺傳結構及指紋圖譜分析

李進 ，陳仕勇 ，趙旭 ，田浩琦 ，陳智華 ，周青平

（1. 西南民族大學青藏高原研究院，四川成都610041；2. 西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，四川成都610041；3. 動物科學國家民委重點實驗室，四川成都610041）

燕麥（Avena sativa）為禾本科（Poaceae）燕麥屬（Avena）一年生草本植物，具有抗旱、耐冷、耐瘠薄等優(yōu)良特性和很高的營養(yǎng)及保健價值［1］，因此成為重要的糧飼兼用作物。燕麥主要分布在北半球的溫帶地區(qū)，國內主要種植省區(qū)為河北、內蒙古、山西，其次是青海、甘肅、寧夏、吉林、云南及四川等［2］。根據(jù)燕麥籽粒外稃的形狀可以劃分為皮燕麥（A. stativa）和裸燕麥（A. nuda），其中皮燕麥主要為飼用。隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，其對優(yōu)質粗飼料的需求越來越大，而燕麥飼草已經(jīng)成為牛羊養(yǎng)殖行業(yè)最重要的優(yōu)質粗飼料來源之一。在我國的青藏高原高寒牧區(qū)，燕麥青干草更是牦牛和藏羊最重要的冬春補飼飼草種類，目前已成為高寒地區(qū)冷季補飼的主要飼草。

選擇適宜的品種是不同地區(qū)進行燕麥飼草生產最重要的環(huán)節(jié)。目前生產中應用的飼用燕麥品種有國產品種和進口品種，如在青藏高原地區(qū)種植的品種包括青引系列、隴燕系列及白燕系列等國產品種，也有包括科納、夢龍、貝勒、哈維等國外品種。已有的引種以及品比試驗結果表明不同燕麥品種在不同的區(qū)域表現(xiàn)了不同的特點和生產潛力［3?4］，但是對這些品種資源的遺傳基礎信息了解較少。同時，如何確保品種的真實性以及利用現(xiàn)有品種資源進行下一步的材料創(chuàng)制及新品種選育等都有待進一步研究。

目前國內外對于燕麥的研究主要集中在栽培技術［5?6］、抗性生理［7?8］、遺傳育種［9?10］等方面。而針對現(xiàn)有品種遺傳親緣關系、品種鑒定方面的研究還較少。基于醇溶蛋白標記的研究初步揭示了青引1 號等15 個燕麥品種之間的親緣關系，但由于其標記位點較少，部分品種間并不能完全區(qū)分［10］。采用基于PCR 技術的分子標記已經(jīng)成為種質資源遺傳親緣關系和指紋圖譜等研究的重要手段。現(xiàn)已有多種分子標記對不同燕麥材料進行了研究，如內部簡單重復序列（inter?simple sequence repeats，ISSR）［11］、DNA 擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）［12］、相關序列擴增多態(tài)性標記（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）［13］等分子標記技術運用在燕麥屬植物遺傳分析中。目標起始密碼子多態(tài)性標記（start condon targeted polymorphism，SCoT）是一種基于翻譯起始位點的目的基因標記，自Collard 等［14］開發(fā)了SCoT 分子標記至今，已有大量研究將其用于植物遺傳多樣性分析，如優(yōu)良牧草資源紫花苜蓿（Medicago sativa）［15］、鴨茅（Dactylis glomerata）［16］等，但在燕麥屬植物中的應用還未見報道。本研究首次利用SCoT 技術對目前國內主要種植的飼用燕麥品種進行了遺傳親緣關系分析，比較了不同燕麥品種之間的遺傳差異，篩選出特異的標記構建了供試燕麥品種的指紋圖譜，從分子水平上為品種鑒定、品種保護及雜交育種等資源創(chuàng)制工作提供了重要的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料選用了36 個飼用燕麥品種，其中國內選育的品種7 個，地方品種1 個，其余28 個均為國外引進品種，所有材料來源信息見表1。2019 年10 月將供試燕麥種子播種于花盆，并置于植物生長培育溫室中。

表1 試驗材料及來源Table 1 Materials used in the study

1.2 指標及測定方法

1.2.1 DNA 提取 每個品種采集20 株的鮮嫩葉片混合后，采用植物基因組提取試劑盒DP305（北京天根生化）提取品種DNA，用NanoDrop-Lite（Thermo Scientific，美國）測定其濃度和純度，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 完整性，將提取完成且符合試驗要求的模板DNA 保存在?20 ℃冰箱，使用前將其稀釋為10 ng·μL?1，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SCoT 引物篩選 本研究選用 Collard 等［14］（SCoT1～SCoT36）及 Luo 等［17］（SCoT37～SCoT80）開發(fā)的SCoT 引物，引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。選取青引1 號、青引2 號、蘇聯(lián)燕麥和青燕1 號4 個品種對80 個SCoT 引物進行篩選，從中選出帶型容易識別且多態(tài)性較好的引物并確定對應的退火溫度，用于進一步的PCR 擴增。

1.2.3 SCoT?PCR 擴增 本試驗的 PCR 反應體系為 20 μL：包含 2 μL 模板 DNA（10 ng·μL?1）、2 μL 引物（10 μmol·L?1）、9 μL 2×Es Taq MasterMix（北京康為世紀生物）和 7 μL ddH2O。PCR 擴增反應在 BIO?RAD T100 Termal Cycler PCR 儀上進行，擴增程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min；退火1 min（48～54 ℃）；72 ℃延伸1.5 min；反應共34 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；最后4 ℃保存。擴增反應結束后采用1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產物，觀察并保存各個引物的擴增結果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在擴增結果中，選取條帶清晰且多態(tài)性好的引物進行統(tǒng)計，在同一遷移位置上，有條帶記為1，無條帶記為0，建立1，0 矩陣。參考劉新龍等［18］的方法對PCR 擴增產物的分子量大小進行估算，用以構建36 個燕麥品種的DNA 指紋圖譜。利用軟件DCFA 1.1 將數(shù)據(jù)導入POPGENE 1.32 中計算多態(tài)性條帶百分比（percentage of polymorphic bands，PPB）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s 基因多樣性指數(shù)（H）和 Shannon’s 多樣性指數(shù)（I）。利用NTSYS-pc 2.10e 軟件進行品種間的DICE 遺傳相似性系數(shù)（genetic similarity coefficients，GS）分析，并利用非加權組平均法（unweighted pair group method with arithmetic average，UPGMA）進行聚類分析，構建燕麥品種聚類樹狀圖。利用軟件Structure 2.3.4 分析燕麥品種的群體結構，將群體數(shù)K值設置為1～20，每個參數(shù)運行5 次，每次運行的burn-in time 設置為100000，重復次數(shù)為50000。計算結果上傳至Structure Harvester（http：//taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/）網(wǎng)頁進行分析，根據(jù)分析結果中的LnP（K）或ΔK值來確定最優(yōu)分群數(shù)K，最終構建36 個燕麥品種的群體結構圖。

2 結果與分析

2.1 SCoT 標記多態(tài)性分析

利用15 個SCoT 引物共擴增出146 條清晰條帶，擴增結果如表2 所示，平均每個引物擴增9.7 條，變幅為6（SCoT80）～14 條（SCoT75）；多態(tài)性條帶共 96 條，平均每個引物擴增多態(tài)性條帶為 6.4 條，變幅為 3（SCoT37）～10 條（SCoT50），多態(tài)性比率（PPB）為 65.75%；Ne變異范圍為 1.15～1.80，平均為 1.46；H范圍在 0.10～0.44，平均為0.27；I范圍在0.15～0.62，平均為0.38。這說明了SCoT 標記對燕麥屬植物具有良好的通用性與多態(tài)性，能夠用于燕麥品種的遺傳變異分析（圖1）。

表2 15 個SCoT 引物擴增結果Table 2 The amplified results of 15 SCoT primers

圖1 引物SCoT48 對燕麥品種的擴增結果Fig.1 Amplified results of SCoT48 primer

2.2 燕麥品種指紋圖譜構建

通過對15 個SCoT 引物的擴增結果進行分析，綜合考慮引物組合數(shù)量和重復性的高低，最終選取可將36 個燕麥品種完全區(qū)分開的4 個引物組合，即選用了SCoT48、SCoT50、SCoT53、SCoT77 用于構建供試燕麥品種的指紋圖譜（圖2）。該指紋圖譜反映了供試的36 個供試燕麥品種具有唯一的擴增譜帶，通過該圖譜能準確、快速地鑒定這36 個品種的燕麥，也可以為相關品種和材料的鑒定提供參考。

圖2 供試燕麥品種指紋圖譜Fig.2 Fingerprinting of 36 oat varieties

2.3 遺傳相似系數(shù)和聚類分析

36 份供試品種間的遺傳相似性系數(shù)（GS）在0.7596～0.9507，平均值為0.8473；其中同為引自美國的品種莫妮卡與海神的遺傳相似系數(shù)最高，親緣關系最近；國內育成品種青燕1 號與加拿大品種貝勒遺傳相似系數(shù)最低，其親緣關系較遠。此外，來自中國、美國、加拿大的燕麥品種間遺傳相似系數(shù)變幅分別為0.7980～0.9121、0.7945～0.9507、0.7742～0.9244，平均值分別為0.8576、0.8517、0.8456，表明來自加拿大的品種的遺傳背景相對較寬。

基于DICE 遺傳相似系數(shù)構建了各供試燕麥品種的UPGMA 聚類樹狀圖（圖3）。如圖顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.836 處大致可將所有品種劃分為4 個類群，其中第Ⅰ類群由來自丹麥的丹麥444 與來自青海的青燕1 號組成；第Ⅱ類群所包含的品種數(shù)最多，共30 個，占總數(shù)的83.3%；其中第Ⅱ類群在遺傳相似系數(shù)為0.866 處又能劃分為7 個亞類。第ⅰ亞類共有10 個品種，國內品種有5 個，其余為來源于挪威、加拿大和美國的5 個引進品種；青引1號與3 個來自加拿大的品種聚為第ⅱ亞類；第ⅲ～ⅵ亞類均由國外的引進品種組成；來自甘肅的隴燕3 號單獨聚為第ⅶ亞類。第Ⅲ類群包含3 個品種，包括青引2 號、青莜3 號和阿壩燕麥，均為國內審定登記品種；來自俄羅斯的蘇聯(lián)燕麥與其他品種燕麥的遺傳距離最遠，單獨劃為第Ⅳ類（100%支持率）。

圖3 SCoT 標記對36 份燕麥品種親緣關系聚類分析Fig.3 Dendrogram of the 36 oat varieties based on SCoT markers using UPGMA method

2.4 群體結構分析

利用Structure Harvester 網(wǎng)頁的分析結果，繪制K值曲線圖（圖4），如圖所示，隨著K值的增大，LnP（K）呈上升趨勢，未出現(xiàn)明顯的拐點，無法確定最優(yōu)分群數(shù)K。因而通過ΔK確定供試材料的群體數(shù)，當ΔK達到最大時，對應的K值為4，于是將供試材料劃分為4個類群，并通過Structure 繪制36 個燕麥品種的群體結構圖（圖5）。4 個類群中，S1類群所包含的品種數(shù)最多，為14 個，且國內大部分品種分布在S1類群中；S2類群除隴燕3 號以外皆為國外品種；S3類群包含品種數(shù)最少，僅有5 個，且全為國外引進品種；S4類群僅青引1 號一個國內品種。

圖4 基于Structure 分析的K 值曲線Fig.4 Curve diagram of K value based on Structure

圖5 36 份燕麥材料群體結構分析Fig.5 Population genetic structure of 36 oat varieties

參照劉麗華等［19］將Q值＜0.6 的品種視為混合來源，Q值＞0.6 的品種視為來源單一。結果顯示，28 個國外引進品種中有19 個品種（67.9%）來源單一，另外有9 個品種（32.1%）擁有混合來源；而8 個國內育成品種中，6 個品種（75%）來源單一，僅有2 個品種（25%）具有混合來源。

3 討論

3.1 燕麥品種遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是種質資源研究中的重要內容，同時也是燕麥遺傳育種的重要依據(jù)。傳統(tǒng)育種常常以生理生化指標作為依據(jù)，這很大程度上依賴于育種家的經(jīng)驗與機遇，存在著極大的盲目性和不可預測性，而利用分子生物育種技術能顯著提高育種效率［20］。分子標記技術作為一種輔助育種手段，可以對種質資源與雜交后代進行基因鑒定，從而提高育種的效率［21］。

目前國內外已有多種分子標記在燕麥種質資源遺傳評價、遺傳圖譜構建及QTLs 定位中應用。劉歡等［22］利用AFLP 標記對來自不同國家的燕麥進行遺傳多樣性研究，得到的多態(tài)性條帶比率為69%。Li 等［23］利用新開發(fā)的SSR 標記建立了燕麥的遺傳圖譜，并揭示品種間的多態(tài)性帶比率為57%。相較于其他分子標記，SCoT 標記具有易開發(fā)、成本低、重復性高等技術優(yōu)勢，本研究首次將SCoT 標記應用于燕麥種質資源研究中。在篩選的15 個SCoT 引物中共擴增出146 條條帶，多態(tài)性條帶96 條，多態(tài)性帶比率為65.75%。蔣林峰等［16］采用SCoT 標記對鴨茅種質資源的檢測中發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性條帶比率為79.55%。熊發(fā)前等［24］對花生（Arachis hypogaea）栽培種質的檢測結果中發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性條帶比率為33.84%；韓國輝等［25］對柑橘（Citrus）的檢測結果顯示多態(tài)性帶比率為54.8%。這都說明SCoT 標記對燕麥種質資源具有較好的擴增效果，能夠在燕麥種質中檢測出較豐富的遺傳多態(tài)性，可以用于燕麥種質資源品種鑒定、遺傳多樣性等分析。

3.2 燕麥品種指紋圖譜的構建

隨著國內對燕麥飼草需求的加大，國內品種數(shù)量及質量都難以滿足其需求，近年來進口燕麥品種備受種植戶的青睞。但是進口的品種也存在品種來源不清，品種名翻譯混亂，甚至有同種異名的情況，所以開展品種的準確鑒定及指紋圖譜構建顯得很有必要。本試驗采用15 個SCoT 引物對36 個國內外常見的飼用燕麥品種的遺傳變異進行研究，揭示了供試品種的基因多樣性指數(shù)在0.10～0.44，Shannon’s 指數(shù)在0.15～0.62，表明SCoT 標記技術在燕麥品種鑒定及指紋圖譜構建中具有較大的潛力。最終，本研究利用4 個SCoT 引物對36 個燕麥品種進行指紋圖譜的構建，所有供試品種能夠完全區(qū)分開，這也表明SCoT48、SCoT50、SCoT53、SCoT77 這4 個引物是進行燕麥種質鑒定的核心引物。蔣林峰等［26］利用SCoT23 與5 個SSR 引物組合，構建了我國主栽的21 個鴨茅品種的DNA 指紋圖譜，這也表明不同的SCoT 標記在不同物種中的擴增效率是不同的，多種分子標記組合在種質鑒定中的效率可能更高。目前燕麥品種的指紋圖譜構建等工作還較落后，為了更好地開展燕麥種質的創(chuàng)新及新品種的選育應盡快開展多種高效分子標記的篩選，并建立燕麥品種指紋圖譜的標準。

3.3 燕麥品種遺傳親緣關系及群體結構分析

本研究基于遺傳相似系數(shù)構建了目前國內主要種植利用的飼用燕麥品種的聚類關系，揭示了供試品種之間的遺傳親緣關系，可以為燕麥雜交育種中的親本選配提供重要的參考。供試的36 個飼用燕麥品種間的遺傳相似性系數(shù)在0.7596～0.9507，平均值為0.8473，遺傳相似性越高，遺傳親緣關系越近。在目前國內選育登記的幾個品種中，蘇聯(lián)燕麥（即青海甜燕麥）單獨聚為一類，表明蘇聯(lián)燕麥的遺傳背景與其他品種存在較大的差異，親緣關系較遠，可以作為雜交的候選親本。青燕1 號與丹麥444（即青海444）遺傳相似系數(shù)最高（0.8879），二者聚為一類，二者均為褐色稃皮，與醇溶蛋白A?PAGE 電泳分析結果一致［9］。青引1 號與隴燕4 號關系較近，青引2 號與隴燕5 號關系較近，這也再次反映了國內燕麥的遺傳背景相對狹窄。在5 個隴燕系列育成品種中，隴燕3 號與其他品種差異較大，可能是由于隴燕3 號的母本丹麥444 和父本Fyris 均來自歐洲；而隴燕1 號和隴燕4 號、隴燕5 號和隴燕1 號、隴燕2 號與加拿大的哈維之間的親緣關系較近，這與它們來源的親本相似有關，如它們的母本多選用甘肅黃燕麥等。而來自美國和加拿大的進口品種中，莫妮卡與海神，貝勒II 與伽利略等品種之間的遺傳相似系數(shù)在0.94 以上，在引種利用中應該盡量避開同時引種。此外，青莜3 號作為供試材料中唯一的裸燕麥，聚類分析將其與國內品種聚為一類，并沒有與其他皮燕麥品種分開，可能是由于燕麥育種過程中選用皮、裸雜交，使裸燕麥與皮燕麥部分品種之間親緣關系較近，這也與齊冰潔等［27］的研究結果相似。

群體結構分析顯示，供試材料大體上分為4 個類群，其中國外品種均勻地分布在4 個類群中，而國內的8 個育成品種及地方品種中，7 個品種分布在S1類群，1 個分布在其他類群，這也說明國內品種分布集中，品種間親緣關系較近。且國內的6 個品種（75%）來源單一，僅青燕1 號與隴燕3 號具有混合來源，說明國內燕麥品種遺傳結構較單一，多樣性不夠豐富，這與聚類分析結果基本一致。劉歡等［11］研究發(fā)現(xiàn)我國皮燕麥遺傳相似性系數(shù)極高，種間差異小。沈國偉等［28］對中加燕麥進行群體遺傳結構分析的結果顯示，來自中國的35 個燕麥品種中，僅有18.75%擁有混合來源。這都表明了目前國內利用的燕麥品種的遺傳基礎較為狹窄，多樣性較低、遺傳結構單一，所以亟須加強國內燕麥品種的發(fā)掘，并開展科學、合理的燕麥引種及雜交等新種質的創(chuàng)制。此外，燕麥的常規(guī)雜交也應與生物技術、基因編輯等手段相結合，盡快構建國內燕麥的生物育種體系。