膠質母細胞瘤中基質金屬蛋白酶組織抑制物1、基質金屬蛋白酶組織抑制物2的表達及與微血管密度的關系△

馬建功，王曉斌，侯欣，李明軒，方樹民，劉亞虎，何承#

河南大學第一附屬醫院1神經外科，2腫瘤科，河南 開封 475000

膠質母細胞瘤是星形細胞瘤中惡性程度最高的膠質瘤，病情發展迅速，預后差。膠質母細胞瘤多位于皮質下，生長在幕上大腦半球各處，可累及對側大腦半球。調查指出，惡性膠質瘤在原發性惡性腦部腫瘤中的占比約為70%，年發病率約為5/10萬，可隨著年齡的增長不斷升高，膠質母細胞瘤的發病例數也逐年增多。另有報道顯示，膠質母細胞瘤在星形細胞瘤中的占比為60%～75%，復發率高，且5年生存率很低。目前人們對于膠質母細胞瘤的發病機制認識尚淺，有研究指出，膠質母細胞瘤患者的腫瘤組織中有大量新血管生成，微血管密度（microvessel density，MVD）顯著增加，提示應將抗血管生成作為膠質母細胞瘤患者重要的治療措施。但是目前針對膠質母細胞瘤患者的常用治療方法效果并不理想，而與新血管生成相關的因素并未得到全面、有效地控制。基質金屬蛋白酶組織抑制物1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1）、基質金屬蛋白酶組織抑制物2（tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP2）均屬于基質金屬蛋白酶的抑制酶，不僅能夠抑制腫瘤細胞生長、浸潤和轉移，還具有抗纖維化作用，已有報道證實在多種惡性腫瘤組織中二者的表達水平偏高，如乳腺癌、肝癌、星形細胞瘤等。有研究指出，TIMP1、TIMP2表達水平越高，惡性腫瘤的惡性程度越高，預后越差。本研究探討了膠質母細胞瘤中TIMP1、TIMP2的表達及其與MVD值的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2019年12月河南大學第一附屬醫院收治的膠質母細胞瘤患者。納入標準：①實施手術治療，經術后病理檢查確診為原發性膠質母細胞瘤；②手術切除組織均以石蠟包埋存檔；③組織學分級為Ⅲ級或Ⅳ級；④臨床資料完整。排除標準：①其他類型腦膠質瘤患者；②膠質母細胞瘤復發患者；③手術切除組織切緣未見正常組織；④術前具有抗腫瘤治療史。依據納入和排除標準，本研究共納入42例患者。其中，男22例，女20例；年齡42～75歲，平均（58.52±8.71）歲；組織學分級：Ⅲ級12例，Ⅳ級30例；腫瘤部位：額葉28例，頂葉5例，丘腦-基底節4例，顳葉2例，胼胝體1例，橋腦1例，小腦1例；最大腫瘤直徑為8～75 mm，平均（35.52±5.85）mm。收集患者的膠質母細胞瘤組織42例和周圍正常組織42例。

1.2 檢測方法

采用蛋白質印跡法（Western blotting）檢測膠質母細胞瘤組織和周圍正常組織中TIMP1、TIMP2的相對表達量。取膠質母細胞瘤組織和周圍正常組織，研磨、勻漿、裂解后對總蛋白進行定量，然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉膜。采用脫脂牛奶封閉，加入鼠抗人TIMP1、TIMP2單克隆抗體，室溫孵育過夜；加入過氧化物酶標記的兔抗鼠TIMP1、TIMP2多克隆抗體，4℃孵育2 h。加入電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）劑，暗室曝光。以β-肌動蛋白（βactin）為內參，目的蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

采用免疫組化兩步法檢測膠質母細胞瘤組織和周圍正常組織中的MVD。采用CD34抗體對微血管染色，可見棕褐色顆粒，為血管內皮細胞的細胞質。采用200倍光鏡對整張切片掃視，確定3個熱點，即微血管密集區域，然后用400倍物鏡計算每個熱點區域中的微血管數，計算3個熱點的平均值記為MVD值。

1.3 觀察指標

比較膠質母細胞瘤組織和周圍正常組織中TIMP1、TIMP2的相對表達量及MVD值；比較不同組織學分級膠質母細胞瘤組織中TIMP1、TIMP2的相對表達量及MVD值；分析膠質母細胞瘤組織中TIMP1、TIMP2表達與MVD的相關性。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 膠質母細胞瘤組織和周圍正常組織中TIMP1、TIMP2相對表達量及MVD值的比較

膠質母細胞瘤組織中TIMP1、TIMP2的相對表達量均明顯低于周圍正常組織，MVD值明顯高于周圍正常組織，差異均有統計學意義（

P

＜0.01）。（表1）

表1 膠質母細胞瘤組織和周圍正常組織中TIMP1、TIMP2相對表達量及MVD值的比較（±s）

2.2 不同組織學分級膠質母細胞瘤組織中TIMP1、TIMP2相對表達量及MVD值的比較

Ⅳ級膠質母細胞瘤組織中TIMP1、TIMP2的相對表達量均明顯低于Ⅲ級膠質母細胞瘤組織，MVD值明顯高于Ⅲ級膠質母細胞瘤組織，差異均有統計學意義（

P

＜0.01）。（表2）

表2 不同組織學分級膠質母細胞瘤組織中-TIMP1、TIMP2相對表達量及MVD值的比較（±s）

2.3 膠質母細胞瘤組織中TIMP1、TIMP2的表達與MVD 的相關性

膠質母細胞瘤組織中TIMP1、TIMP2的表達均與MVD值呈負相關（r=-0.796、-0.815，P＜0.01）。

3 討論

原發性膠質母細胞瘤的分子改變以表皮生長因子受體擴增和過量表達為主，可導致表皮生長因子水平升高，新生血管大量生成，對腦組織產生浸潤性損壞，還可導致頭痛、偏癱、失語、偏盲等。膠質母細胞瘤多呈浸潤性生長，可侵犯幾個腦葉和深部結構，對患者的身心健康造成嚴重危害。盡管目前臨床上常用手術、放療和化療等方法治療膠質母細胞瘤患者，但效果并不理想，主要原因如下：膠質母細胞瘤的惡性程度高，臨床治療難度大；膠質母細胞瘤可生成大量新生血管，導致腫瘤復發、浸潤和轉移，甚至危及患者的生命安全。然而目前人們對新生血管生成的機制認識尚淺，其治療措施也缺乏針對性。因此該領域工作者應積極探索與膠質母細胞瘤患者新生血管生成相關的因素，以期為臨床抗腫瘤治療的研究提供新方向。

新生血管生成是一個涉及多種細胞和分子的復雜過程，主要包括激活期血管基底膜降解、血管內皮細胞激活、血管內皮細胞增殖和遷移、新生血管以及血管網重建等，還可形成小的血管分支。基質金屬蛋白酶組織抑制物（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）對細胞生長、凋亡均具有直接作用，而TIMP1、TIMP2作為該家族的主要成員，不僅可參與細胞生長、增殖與凋亡的調控，還可影響新生血管生成，主要原因可能是影響細胞外基質金屬蛋白酶的降解。研究指出，新生血管生成是從基底膜降解開始的，即鄰近血管生成刺激因子的靜脈基底膜降解，然后內皮細胞變形，生成血管芽伸入細胞外基質，與此同時細胞外基質金屬蛋白酶增多，TIMP1減少，新生血管和基底膜生成，進而參與惡性腫瘤的發生和發展。另有報道顯示，膠質瘤患者中細胞外基質金屬蛋白酶/TIMP平衡受損，TIMP1和TIMP2減少，其中TIMP1可直接參與新生血管生成，TIMP2不僅可與整合素α3β結合，還可誘導基因表達將細胞周期阻滯于G期，抑制細胞遷移，抑制新生血管生成。本研究中，膠質母細胞瘤組織中TIMP1、TIMP2的相對表達量均明顯低于周圍正常組織，MVD值明顯高于周圍正常組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）；Ⅳ級膠質母細胞瘤組織中TIMP1、TIMP2的相對表達量均明顯低于Ⅲ級膠質母細胞瘤組織，MVD值明顯高于Ⅲ級膠質母細胞瘤組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。說明膠質母細胞瘤組織中TIMP1、TIMP2表達水平偏低，MVD值偏高，且惡性程度越高，上述指標異常程度越嚴重。

MVD是新生血管生成的重要標志，TIMP1和TIMP2的表達與神經微絲陽性的神經元均具有緊密相關性，且二者均可影響神經元由增生狀態向最終分化狀態轉化。因此TIMP1和TIMP2均可直接影響膠質母細胞瘤的新生血管生成潛能和惡性程度，惡性程度越高，MVD值越高，而TIMP1和TIMP2表達水平越低。國外報道指出，血管內皮管腔的形成依賴于基質金屬蛋白酶/TIMP平衡，各種因素加入后一旦打破二者的平衡關系，便可影響新生血管生成和腫瘤細胞的浸潤與轉移，使腫瘤組織的惡性潛能增加。既往報道顯示，膠質母細胞瘤中TIMP1和TIMP2缺乏，基質金屬蛋白酶高表達，前者可能與瘤周水腫無關，而后者與瘤周水腫密切相關。本研究結果與上述報道相符，膠質母細胞瘤組織中TIMP1和TIMP2的表達均與MVD呈負相關，提示TIMP1和TIMP2表達水平越低，MVD值越高，新生血管生成越多，腫瘤的惡性程度越高。

綜上所述，膠質母細胞瘤組織中TIMP1和TIMP2的表達水平均明顯低于周圍正常組織，MVD值均明顯高于周圍正常組織，且惡性程度越高，TIMP1和TIMP2的表達水平越低，MVD值越高，TIMP1和TIMP2的表達與MVD均呈負相關。結合本研究結果，建議嘗試將TIMP1和TIMP2作為膠質母細胞瘤臨床治療的新靶點，以降低MVD值，抑制新生血管生成。如何采取有效的措施提高膠質母細胞瘤患者中TIMP1和TIMP2的表達水平，降低MVD值應作為后期研究的重點。