C-Kit、父系表達基因10在原發性肝癌患者中的表達及與臨床特征和預后的關系

張曉虎，裴旭東，閃海霞，朱喜增

南陽市中心醫院感染科，河南 南陽 473001

原發性肝癌（primary liver cancer，PLC）是指發生于肝細胞或肝內膽管細胞的惡性腫瘤，是中國常見的惡性腫瘤之一。據調查顯示，近年來中國PLC的發病率呈逐漸上升且年輕化趨勢。由于PLC早期無典型癥狀，患者常在中晚期出現肝區持續性疼痛、肝大、黃疸、肝功能減退、門脈高壓綜合征等，若不及時治療，將對患者的生命安全造成嚴重威脅。目前，早期診斷和評估PLC患者病情并采取治療措施是提高PLC診療率的關鍵。相關研究發現，惡性腫瘤的發生與遺傳印記相關基因及原癌基因密切相關。因此，PLC的早期診斷及早期治療可從分子水平研究入手。C-Kit作為重要的細胞原癌基因，是酪氨酸激酶受體蛋白家族的一員，參與造血干細胞的分化、增殖，與胃腸間質瘤及其他腫瘤密切相關，印記基因父系表達基因10（paternally expressed gene 10，PEG10）具有高度的組織特異性，隨著腫瘤分化程度的增加，其表達水平升高，已被證實與腫瘤進展具有相關性。但目前臨床上關于PEG10基因與PLC的相關性尚未見明確報道。本研究探討了C-Kit和PEG10蛋白在PLC患者中的表達及與臨床特征和預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年2月至2017年2月南陽市中心醫院收治的接受肝穿刺治療且經病理組織檢查確診的PLC患者。納入標準：均經肝穿刺治療且術后病理學檢查確診為PLC。排除標準：合并心、肝、腎、肺疾病；術后隨訪資料不完整。依據納入和排除標準，本研究共納入90例患者。其中，女44例，男46例；年齡32～76歲，平均（56.06±6.32）歲；臨床分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期23例，Ⅲ期21例，Ⅳ期19例；組織學類型：肝細胞癌48例，膽管細胞癌42例。收集PLC患者的PLC組織90例及癌旁正常組織90例。

1.2 免疫組織化學染色法檢測C-Kit和PEG10蛋白表達

采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法（streptavidin-perosidase，SP）檢測PLC組織和癌旁正常組織中C-Kit和PEG10蛋白的表達情況。將石蠟包埋的組織標本連續2 μm切片，60℃烘烤，二甲苯脫蠟，浸泡3次，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3次；滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育15 min，PBS沖洗；滴加一抗（C-Kit或PEG10多克隆抗體，濃度為1∶100），室溫孵育1 h，PBS沖洗。滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）聚合物，室溫孵育30 min；滴加山羊抗兔二抗，室溫孵育30 min；二氨基聯苯胺顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。采用PBS代替一抗作為對照。

1.3 免疫組織化學染色結果判斷

隨機選擇每張切片的5個視野，根據染色強度和視野中陽性細胞比例進行評分。依據染色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；依據陽性細胞比例評分：＜25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強度評分與陽性細胞比例評分相乘，0～1分為陰性（-），2～4分為弱陽性（+），5～8分為中等陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。其中，陰性（-）和弱陽性（+）為低表達，中等陽性（++）和強陽性（+++）為高表達。

1.4 觀察指標及隨訪

記錄患者的臨床資料，包括年齡、性別、臨床分期、組織分化程度、甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）水平、組織學類型、預后評分。采用格拉斯哥昏迷評分法（Glasgow coma scale，GCS）根據患者睜眼、語言、肢體運動等進行預后評分，總分為15分，評分越高，提示意識狀態越好。記錄C-Kit和PEG10蛋白表達情況及預后情況。比較PLC組織和癌旁正常組織中C-Kit和PEG10蛋白的表達情況，比較不同臨床特征PLC患者PLC組織中C-Kit和PEG10蛋白的表達情況。所有患者治療結束后均隨訪3年，隨訪截止時間為2020年2月29日，隨訪率為100%。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 PLC 組織和癌旁正常組織中C-Kit和PEG10蛋白表達情況的比較

PLC組織中C-Kit蛋白的高表達率為75.56%（68/90），明顯高于癌旁正常組織的13.33%（12/90），差異有統計學意義（χ=70.560，P＜0.01）；PLC組織中PEG10蛋白的高表達率為81.11%（73/90），明顯高于癌旁正常組織的8.89%（8/90），差異有統計學意義（χ=94.837，P＜0.01）。（表1、表2）

表1 PLC組織和癌旁正常組織中C-Kit蛋白的表達情況

表2 PLC組織和癌旁正常組織中PEG10蛋白的表達情況

2.2 不同臨床特征PLC患者PLC組織中C-Kit和PEG10蛋白表達情況的比較

不同年齡、性別、組織學類型的PLC患者PLC組織中C-Kit和PEG10蛋白表達情況比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）。臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、AFP水平＞200 ng/ml的PLC患者PLC組織中C-Kit蛋白高表達率分別明顯高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、AFP水平≤200 ng/ml的患者，差異均有統計學意義（

χ

=14.739、10.222、10.458，

P

＜0.01）；臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、AFP水平＞200 ng/ml的PLC患者PLC組織中PEG10蛋白高表達率分別明顯高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、AFP水平≤200 ng/ml的患者，差異均有統計學意義（

χ

=12.622、7.626、8.506，

P

＜0.01）。（表3）

表3 不同臨床特征PLC患者PLC組織中C-Kit和PEG10蛋白的表達情況（n=90）

2.3 預后情況

3年隨訪結束后，90例PLC患者的3年生存率為51.11%（46/90）。

2.4 PLC 患者預后影響因素的單因素分析

不同年齡、性別PLC患者的3年生存率比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）。臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、預后評分＜7分、C-Kit蛋白高表達、PEG10蛋白高表達、AFP水平＞200 ng/ml的PLC患者的3年生存率分別明顯低于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、預后評分≥7分、C-Kit蛋白低表達、PEG10蛋白低表達、AFP水平≤200 ng/ml的患者，差異均有統計學意義（

P

＜0.01）。（表4）

表4 PLC患者預后影響因素的單因素分析（n=90）

2.5 PLC 患者預后影響因素的多因素分析

多因素Logistic回歸分析結果顯示，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、預后評分＜7分、C-Kit蛋白高表達和PEG10蛋白高表達均是PLC患者預后的獨立危險因素（

P

＜0.05）。（表5）

表5 PLC患者預后影響因素的多因素分析（n= 90）

3 討論

據流行病學統計，全球消化系統惡性腫瘤中肝癌的病死率居第3位，中國作為肝癌的高發區，肝癌死亡例數占全球總死亡例數的46%左右。因此，對PLC的早期診斷、治療及相關分子生物學研究一直是臨床研究熱點。

隨著生物學研究的不斷深入，有學者發現相關蛋白改變在PLC的發生發展中具有重要作用，且與PLC的預后相關。本研究結果顯示，PLC組織中C-Kit和PEG10蛋白的高表達率均明顯高于癌旁正常組織，且臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、AFP水平＞200 ng/ml的PLC患者PLC組織中C-Kit和PEG10蛋白高表達率分別明顯高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、AFP水平≤200 ng/ml的患者。說明PLC的發生和發展與C-Kit和PEG10蛋白有著密切聯系。PEG10是一種新發現的遺傳印記相關基因，研究發現，與p53、p16、c-myc等腫瘤相關基因比較，PEG10具有更高的肝癌組織特異性，其具有作為新的肝癌早期診斷標志物的潛力。有學者采用免疫組織化學染色法檢測肝癌中PEG10蛋白表達，結果發現，肝癌組織中PEG10蛋白表達水平明顯高于癌旁正常組織，且隨著肝癌分化程度的降低，其表達增加，與本研究結果一致。C-Kit基因是HZ4貓科肉瘤病毒kit癌基因的同源物，位于人染色體4q12-13。C-Kit是白色斑點顯性基因的等位基因，屬于原癌基因，其產物是Ⅲ型酪氨酸激酶，編碼145 kD的跨膜糖蛋白——酪氨酸激酶受體，后者即為C-Kit受體。周芳穎等研究顯示，C-Kit基因突變可刺激腫瘤細胞的持續性增殖和抗凋亡信號的失控，有利于腫瘤的惡性克隆。相關研究發現，幾乎所有的Cajal細胞都表達C-Kit，黑色素瘤、生殖細胞及造血細胞中也有C-Kit表達。由此可知C-Kit與PLC具有相關性，與本研究結論一致。

本研究結果還顯示，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、預后評分＜7分、C-Kit蛋白高表達和PEG10蛋白高表達均是PLC患者預后的獨立危險因素（P＜0.05）。考慮原因如下：隨著腫瘤臨床分期的升高，患者病情加重，導致預后情況較差；組織分化程度較低時，肝癌細胞的分化能力增強，惡性程度增高，導致患者的預后較差；作為判斷預后的預后評分可在一定程度上反映病情嚴重程度，預后評分越低，說明患者病情越重，其生存率及預后均會受到影響。

綜上所述，C-Kit和PEG10在PLC組織中高表達，其表達情況與患者的臨床特征及預后有關，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、預后評分＜7分、C-Kit蛋白高表達和PEG10蛋白高表達均是PLC患者預后的獨立危險因素，C-Kit和PEG10蛋白可作為理想的PLC預后標志物。