尼古丁作用下牙周膜細胞c-Fos通路表達變化的相關研究

陳靜濤，周志斐，王 燕，宋 薇，李保東，陳新釗，衛克文

牙周炎為口腔兩大常見病之一，是由于細菌感染導致牙周組織出現慢性感染性炎癥的一種疾病。其典型癥狀為牙槽骨吸收，牙齒松動脫落等。吸煙是牙周炎的重要影響因素，吸煙者牙周炎患病率高，病情重，治療效果及預后較差[1]。煙草中的尼古丁被證實在牙周組織的破壞過程中發揮重要作用。Kim等[2]證實尼古丁通過結合牙周膜干細胞上的煙堿型乙酰膽酰受體α7亞型（α7 acetylcholine receptor，α7 nAChR），加快牙周膜干細胞凋亡，降低牙周組織修復速度，且該現象存在濃度依賴性。課題組前期研究結果發現，大鼠和人類的牙周組織中存在α7 nAChR的功能性表達，尼古丁通過α7 nAChR在牙周炎發生發展過程中所發揮的破壞性效應可被受體特異性拮抗劑α-銀環蛇毒素（α-BTX）所部分抑制[3]。然而尼古丁和α7 nAChR結合后下游究竟是通過何種途徑造成牙周破壞，具體機制仍不清楚。c-Fos是破骨細胞分化過程中的關鍵因子，c-Fos基因敲除鼠表現為原發性脆骨硬化癥，過度表達c-Fos的轉基因鼠可出現軟骨肉瘤等癥狀[4]。c-Fos在破骨細胞分化過程中是RANKL重要調控因子，可調控下游因子促進破骨細胞分化[5]。Chang等[6]在實驗中發現，尼古丁可促進人牙周膜中c-Fos的基因表達，且其效果顯著依賴于細胞硫醇的水平。為進一步研究尼古丁作用于人牙周膜細胞后的效應機制，本研究檢測了尼古丁作用后細胞c-Fos與α7 nAChR的相互關系，旨在探討尼古丁對人牙周膜細胞的影響，為進一步揭示尼古丁參與吸煙相關性牙周炎的可能功能作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 尼古丁（Wako，日本）；DMEM培養基（GibcoBRL公司，美國）；胎牛血清（云天生物技術研究所，中國）；α-BTX（Santa，美國）；c-Fos小鼠抗人IgG單克隆抗體，山羊抗小鼠IgG二抗，RT-PCR試劑盒（Takara，中國）；RNA提取試劑盒（Omega，美國）；ABI7500實時定量PCR儀（美國應用生物系統公司，美國）；電泳儀，轉膜儀（Bio-Rad，美國）；低溫離心機，微量移液器（Eppendorf，德國）。

1.2 牙周膜細胞培養 自空軍軍醫大學附屬唐都醫院門診部口腔科收集健康無齲壞及根尖周感染的第一前磨牙，供體均為12～18歲青少年，牙齒均因正畸治療需要而被拔除。刮取根中1/3段牙周膜組織。滴管轉移組織塊及培養液至離心管中，1 000 r pm離心5 min棄上清，加入約1 ml DMEM培養液（含20%胎牛血清）至離心管，將組織塊吹打均勻，用滴管吸出，加入六孔板底，用蓋玻片覆蓋組織塊，置于37 °C恒溫孵箱（5% CO2、濕度100%）培養。當孔內細胞長至80%時，PBS沖洗2遍，每孔滴加約1 ml 0.25%的胰蛋白酶，反復吹打制成細胞懸液，1 000 rpm離心5 min后加入1 ml DMEM培養液（含20%胎牛血清），吹打均勻以1:3體積比轉移至培養瓶后置于恒溫培養箱。待細胞數量約占六孔板底面積80%時再次傳代，5代細胞用于后續試驗。取第5代人牙周膜細胞，以2×104個/ml接種于六孔板中，置于37 ℃恒溫孵箱中培養。在細胞鋪滿六孔板底部80%，形態、密度均達到良好狀態時加入含不同濃度尼古丁的培養液（0 M、10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、10-7M）作用不同時間（0、1、2、4、8、24 h），檢測尼古丁作用于人牙周膜細胞后c-Fos mRNA和蛋白的表達變化。α-BTX作用濃度為10-8M，隨尼古丁同時加入培養液以觀察其對尼古丁作用的阻斷效應。分別以無尼古丁作用和尼古丁作用0 h為空白對照。

1.3 RNA提取及RT-PCR檢測 不同分組及不同處理細胞終止實驗后行RT-PCR檢測。采用Omega提取細胞總RNA，使用反轉錄試劑盒（Takara）以10 μl反應體系反轉錄成cDNA用于PCR擴增。基因擴增儀按照預設程序進行反轉錄及基因擴增。反應條件為：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃終延伸2 min，35個循環。所得PCR產物行凝膠電泳（120 V，25 min）實驗，Bio-RadD凝膠定量軟件Quantity One 分析目的基因凝膠電泳結果，采集圖像。反應完成后，采用CFX Manager軟件（Version 2.1）對數據進行分析，計算每組樣本Ct值，以β-actin為內參，計算2-△△Ct值，基于溶解曲線判斷擴增產物是否具有特異性。引物由上海生工生物科技有限公司設計合成（β-actin：上游為5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'下游為5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'；c-Fos：上游為5'-CTCCAGTGCCAACTTCATTCC-3'；下游為5’-CATCTTATTCCTTTCCCTTCGG-3'）。

1.4 蛋白提取和Western blot檢測 不同分組及不同處理細胞終止實驗后提取蛋白，各組蛋白濃度利用BCA法進行測定，定量后進行凝膠電泳，每個泳道中的樣本蛋白含量相同。轉移目的蛋白至NC膜上后，封閉，加入c-Fos小鼠抗人IgG單克隆抗體，封膜，過夜孵育；洗膜，封山羊抗小鼠IgG二抗，掃膜；Bio-Rad Quantity One軟件進行蛋白條帶定量分析。

1.5 統計學處理 應用SPSS 18.0軟件對實驗數據進行分析，3組及以上的比較采用單因素方差分析(Oneway analysis of variance)，對實驗組和對照組檢測數據進行檢驗，組間兩兩比較采用Tukey檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 尼古丁作用后c-Fos mRNA變化的時間梯度及濃度梯度實驗 PCR結果提示，10-5M濃度尼古丁作用于牙周膜細胞1 h后c-Fos mRNA表達顯著升高(圖1)，而隨著作用時間的延長，c-Fos表達逐漸減低。當作用時間限定為1 h時，PCR結果提示，較之于10-3M濃度，10-4M濃度尼古丁作用于牙周膜細胞后c-Fos mRNA表達顯著升高（圖2）。10-5M濃度尼古丁作用下c-Fos表達逐漸減低（P＜0.05）。考慮尼古丁對細胞的毒性作用，本課題后續采用10-5M尼古丁作用于人牙周膜細胞1 h觀察相關指標的改變。

圖1 尼古丁作用不同時間后人牙周膜細胞c-Fos mRNA的表達改變

圖2 不同濃度尼古丁對人牙周膜細胞c-Fos mRNA表達改變的影響

2.2 尼古丁和/或α-BTX對c-Fos蛋白表達的影響 Western blot及其半定量檢測結果提示，10-5M尼古丁作用于人牙周膜細胞1 h后，細胞c-Fos蛋白表達顯著上調，約為空白對照的3倍，加入10-8M α-BTX后，c-Fos蛋白表達上調的趨勢得到顯著抑制，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 尼古丁對人牙周膜細胞c-Fos蛋白的影響

2.3 尼古丁和/或α-BTX對c-FosmRNA表達的影響 以10-5M尼古丁作用于牙周膜細胞1 h后，電泳圖顯示：10-5M尼古丁可上調c-Fos mRNA的表達，而α7 nAChR拮抗劑α-BTX可顯著抑制這一作用，差異具有統計學意義(P＜0.05)。單獨α-BTX作用于牙周膜細胞后，c-Fos mRNA的表達并未發生顯著改變（P＞0.05）（圖4）。實時定量PCR結果與反轉錄PCR結果類似（圖5）。

圖4 尼古丁對人牙周膜細胞c-Fos mRNA表達的影響

圖5 實時定量PCR檢測尼古丁對人牙周膜細胞c-Fos mRNA表達的影響

3 討論

牙周炎發病率高，愈后較差，是導致成年患者牙列缺損、甚至缺失的主要病因[7]。吸煙是引起牙周炎的高危因素之一。尼古丁是煙草中的主要生物堿，占煙草生物堿總量的95%以上。尼古丁對牙周組織的影響多樣。尼古丁能夠降低牙周組織對炎性反應的防御能力[8]；從而加重牙槽骨吸收,最終影響牙周病的治療效果及預后[9]。但尼古丁引起牙周組織炎癥反應的具體機制尚不明了，仍有待進一步闡明。

近年來，α7 nAChR逐漸成為研究吸煙相關性牙周炎發病機制的熱點。α7 nAChR作為尼古丁的特異性受體，與吸煙相關性牙周炎的發病過程息息相關[10]。課題組前期研究結果同樣指出大鼠和人類的牙周膜組織及細胞中存在α7 nAChR的功能性表達，尼古丁可上調α7 nAChR表達造成實驗性牙周炎大鼠牙周組織破壞，且牙槽骨吸收程度與α7 nAChR的表達呈正相關[3，11]。α7 nAChR在口腔組織中廣泛分布，尼古丁對其表達的上調作用能夠被受體特異性拮抗劑α-BTX部分逆轉。α-BTX濃度選擇為課題組沿用濃度10-8M，這是由于α-BTX本身具有一定的細胞毒性，選擇這個濃度，既能發揮其拮抗α7 nAChR的作用，又能避免α-BTX本身對細胞的毒性作用干擾實驗結果。然而，尼古丁同受體結合后下游具體調控機制及其對牙周組織的生物學意義仍不明了。

c-Fos基因同樣在細胞中廣泛存在，并對細胞的生長分化發揮調控作用。當細胞受到外界刺激，數十分鐘內即可表達產物為55 kDa的c-Fos蛋白，持續數十小時后恢復至正常[12]。c-Fos蛋白作為AP-1的成分，參與了細胞的凋亡及細胞對損傷的反應[13]。c-Fos基因作為早期即刻基因，有文獻報道稱在人牙周成纖維細胞中也發揮了損傷應激作用，廣泛參與機體組織修復和炎性傳導。尼古丁可上調c-Fos mRNA的表達，且其在1 h后達到峰值[6]，這與本研究實驗結果相似。Beer等[14]在紅藻氨酸癲癇模型中用原位雜交技術檢測發現c-Fos蛋白表達水平與c-Fos mRNA表達具有高度一致性；Sng等[15]在紅藻氨酸癲癇模型中應用免疫組化技術也同樣檢測到c-Fos蛋白與c-Fos mRNA可在應激反應早期發生改變。這些結果均印證了本實驗結果的可重復性。本實驗也發現c-Fos基因及蛋白在尼古丁作用1 h后出現顯著升高。而在尼古丁作用濃度選擇上，雖然10-4M尼古丁在作用1 h后c-Fos mRNA表達改變最為顯著，但考慮到尼古丁的劇毒性，10-4M尼古丁或可使多數細胞出現凋亡，發生不可逆反應，為確保實驗結果不受其他因素干擾，作者采用10-5M尼古丁開展相關研究。且課題組前期實驗已經證實，這一濃度尼古丁最符合吸煙者齦溝液中尼古丁的實際濃度,最具有生理學角度的意義[3，11]。本研究結果同樣也證實10-5M尼古丁作用后c-Fos mRNA表達也出現了顯著上調。

動物實驗結果提示尼古丁可使小鼠海馬結構c-Fos蛋白表達升高，學者認為其原因在于尼古丁激活了海馬結構中的相關受體，釋放了神級遞質作用于突觸后膜，轉而激活第二信使誘導c-Fos蛋白表達上調[16]。有研究證實尼古丁在人牙周膜細胞中可上調c-Fos基因的表達并顯著依賴于細胞硫醇的水平[6]。c-Fos在破骨細胞分化過程中也能夠調控RANKL的功能活性，RANKL激活后通過相關信號通路作用促進前體細胞成為成熟的破骨細胞[17]。Yang和Peng[18]通過免疫組化及統計學方法證實c-Fos與RANKL在根尖周病損中共同表達，并且表達變化趨勢相同，呈正相關。由此作者推測，尼古丁作用于牙周膜細胞后表達升高的c-Fos調控了破骨細胞活化，進而參與牙周炎的發生發展過程。

本研究發現尼古丁作用于人牙周膜細胞后促進了c-Fos的表達，這一作用可被α7 nAChR拮抗劑α-BTX拮抗。提示尼古丁可能通過作用于α7 nAChR調節c-Fos活性，參與牙周組織的破壞過程。