人工周期-凍融胚胎移植結局的相關影響因素分析

許浩麗，蔡桂豐，許偉標，楊嫦玉，張麗娜

(珠海市婦幼保健院生殖中心,珠海 519001)

自從1985年人類第一例凍融胚胎移植(FET)健康嬰兒出生以來，FET技術迅速發展，成為了人類輔助生殖技術重要的部分，可以避免新鮮周期超生理激素水平對妊娠結局的不良影響，并減少促排卵并發癥如卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的風險等、增加取卵周期的累積成功率。越來越多的中心采用FET周期，而且獲得與鮮胚移植周期相當的成功率。包括內膜準備方案在內的眾多因素影響到FET周期的成功率。激素替代人工周期(HRT)方案簡單、方便、經濟，而且成功率較高，是FET周期最常用的準備內膜方法之一。本研究回顧性分析我中心于2019～2020年采用HRT方案準備內膜的FET周期(HRT-FET周期)的臨床資料，分析相關的影響因素，旨在為進一步改善HRT-FET周期臨床結局提供數據積累和參考。

資料與方法

一、研究對象

2019年1月至2020年12月在珠海市婦幼保健生殖中心接受FET治療的不孕癥患者。

納入標準：年齡≤40歲；第一周期IVF/ICSI-ET助孕；全胚冷凍后第1次FET周期；HRT方案準備內膜；移植評分Ⅰ～Ⅱ級胚胎[1]。

二、診療回顧

1.子宮內膜準備：所有患者于月經第3天經陰道B超檢查子宮內膜厚度及排除子宮腔異常情況，比如子宮內膜息肉等。如內膜厚度>6 mm，或卵巢內有>10 mm的液暗，在月經周期第5天或第7天再次陰道B超檢查，如內膜厚度≤6 mm，卵泡消失或縮小即啟動HRT內膜準備，否則即取消周期，或更改內膜準備方案。

內膜準備方案一：遞增方案。口服戊酸雌二醇(仙靈制藥，德國)3 mg bid，連續使用6 d；采用陰道B超監測子宮內膜厚度及形態，若子宮內膜厚度<8 mm、A型，戊酸雌二醇用量至4 mg bid，連續使用5～6 d。子宮內膜厚度增長至≥8 mm，檢測血清雌二醇(E2)>367 pmol/L、孕酮(P)<3.18 nmol/L，同日轉化內膜(詳見以下轉化方案)；若子宮內膜厚度仍<8 mm，增加戊酸雌二醇用量至5 mg bid×3 d、6 mg bid×3 d，依次遞增，如服用戊酸雌二醇達17～21 d，子宮內膜厚度仍<8 mm或≥16 mm或檢測血清E2、P水平未能達到前述水平即取消周期。

內膜準備方案二：恒量方案。口服戊酸雌二醇3 mg bid，連續6 d；采用陰道B超監測子宮內膜厚度及形態，子宮內膜厚度增長至≥8 mm、A型，繼續口服戊酸雌二醇3 mg bid，連續5～6 d。檢測血清激素水平，E2>367 pmol/L、P<3.18 nmol/L且子宮內膜厚度增長至≥8 mm，同日轉化內膜；如檢測血清E2、P水平未能達到上述水平，子宮內膜厚度增長至≥8 mm，繼續口服戊酸雌二醇3 mg bid×3 d，每3 d檢測血清E2、P水平，達到上述水平且子宮內膜厚度增長至≥8 mm即轉化內膜；如服用戊酸雌二醇達17～21 d，檢測血清E2、P水平未能達到上述水平或子宮內膜厚度<8 mm或≥16 mm即取消周期。

轉化內膜方案：方案一(遞增方案)：轉化內膜第1天黃體酮(天津金耀)20 mg im qd，第2天黃體酮40 mg im qd，第3天黃體酮60 mg im qd，第4天開始黃體酮80 mg im qd×14 d直到驗孕日；戊酸雌二醇原量服用至驗孕日。方案二(恒量方案)：轉化內膜第1天始黃體酮80 mg im qd×17 d直到驗孕日；戊酸雌二醇原量服用至驗孕日。

2.胚胎冷凍及解凍：入組患者的卵裂期胚胎或囊胚均進行玻璃化冷凍及解凍，玻璃化冷凍及解凍操作與規程參照我中心的SOP手冊。胚胎解凍后培養至當天下午，解凍后評分胚胎達Ⅰ～Ⅱ級者進行移植并入組；評分不達標者剔除出組。

3.胚胎移植：卵裂期胚胎于轉化內膜的第4天上午解凍，下午移植；囊胚于轉化內膜的第6天上午解凍，下午移植。移植胚胎數分4種情況：卵裂期胚胎1個或2個；囊胚1個或2個。患者取膀胱截石位，生理鹽水抹洗外陰、陰道及宮頸，在B超監測下，將胚胎移植管的末端輕緩插至距宮底1～1.5 cm左右的位置，緩慢注入胚胎，稍等片刻后，緩慢拔出胚胎移植管，患者平臥0.5～1 h。

4.妊娠判定：胚胎移植后2周行血清HCG檢測，>5 U/L者為HCG陽性。胚胎移植后4～5周B超檢查胚胎發育情況及妊娠胎數，凡宮腔內有妊娠囊或流產、異位妊娠、多部位同時妊娠，經病理檢查證實有絨毛者，均為臨床妊娠。

三、觀察分析指標

觀察分析指標：年齡，人工周期子宮內膜準備啟動日的子宮內膜厚度，戊酸雌二醇的服用方案，戊酸雌二醇服用天數，轉化日血清E2、P水平，轉化日內膜厚度，轉化內膜黃體酮的使用方案；移植胚胎類型及胚胎數，妊娠結局。

四、統計學分析

結 果

一、患者一般資料

本研究共納入768個FET周期，其中妊娠組476周期，非妊娠組292周期。妊娠組平均年齡較非妊娠組小約3歲，有顯著性差異(P<0.05)；而兩組間不孕年限、不孕因素、竇卵泡數(AFC)、體質量指數(BMI)、基礎激素水平(FSH、 LH、E2)均無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 患者基礎資料[(-±s)，n(%)]

二、FET周期內膜準備方案及胚胎移植相關參數比較

不同年齡、準備內膜啟動日的不同子宮內膜厚度、戊酸雌二醇服用時長、轉化日內膜厚度和移植胚胎類型/數量等因素下的妊娠結局比較，均有顯著性差異(P<0.05)；戊酸雌二醇的服用方案、轉化日血清雌二醇水平和轉化內膜黃體酮的使用方案等相關因素下的妊娠結局比較，均無統計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 FET周期內膜準備方案及胚胎移植不同參數下的妊娠結局

三、多因素回歸分析

將妊娠結局比較有顯著性差異的相關因素進行Logistic回歸分析。多因素Logistic回歸分析顯示：年齡、準備內膜啟動日的子宮內膜厚度、轉化日內膜厚度和移植胚胎類型/數量與HRT-FET妊娠結局相關(分別為OR=1.660、0.510、1.468、2.891，P<0.05)；戊酸雌二醇服用天數未能進入方程(OR=0.815，P>0.05)，提示與妊娠結局不相關(表3)。

表3 HRT-FET妊娠結局影響因素的多因素Logistic回歸分析

討 論

隨著FET技術水平進步，獲得了與鮮胚移植周期相似甚至更高的成功妊娠率。影響FET妊娠結局的因素很多，根據本研究分析結果，討論如下。

年齡是女性生育能力的一個重要影響困素。青春期后女性卵子的質量及數量隨著年齡的增長而下降。在輔助生殖技術的運用中，年齡是決定妊娠結局的關鍵，因為年齡與胚胎質量成正相關[2]。有研究顯示，自然周期與HRT周期兩種子宮內膜準備方案的FET周期中，在相同的年齡段妊娠結局相似[3]。本研究顯示HRT-FET周期中，妊娠組年齡顯著小于非妊娠組，回歸分析也顯示年齡是妊娠結局的相關因素，分析認為年齡對FET妊娠結局的影響，是因為年齡小者胚胎質量更好。有研究分析了相同年齡段的贈卵周期，不同年齡段受體的妊娠率無顯著差異[4]，說明年齡對輔助生殖技術成功臨床妊娠的影響，依然是通過胚胎質量決定，與內膜準備方案相關不大。

胚胎著床的相關因素除了胚胎質量，還有子宮內膜容受性[5]。子宮內膜容受性是指子宮內膜對胚胎定位、黏附、著床等的接受能力，子宮內膜形態、厚度、內膜下血流、內膜上的激素受體因子均影響著子宮內膜容受性及胚胎與內膜的同步性。目前多數研究均顯示內膜轉化日內膜的厚度與FET的臨床妊娠率相關，內膜的厚度在一定的范圍內臨床妊娠率更高。有研究者將FET周期轉化日內膜的厚度分為7～12 mm組、>12 mm組及≤7 mm組，通過比較研究發現，轉化日子宮內膜厚度≤7 mm組的臨床妊娠率最低[6]。宋夢玲等[7]研究結果亦顯示FET周期轉化日內膜厚度≥8 mm患者的臨床妊娠率顯著高于轉化日內膜厚度<8 mm者。本研究也提示FET周期中轉化日內膜厚度在8～14 mm范圍內臨床妊娠率高，回歸分析也進入方程，提示與HRT-FET周期妊娠結局相關。在臨床工作中我們發現有部分薄型子宮內膜(<6 mm)患者依然可以成功妊娠(限于操作標準，本研究中未顯示相關結果)，提示影響胚胎著床的因素還可能有子宮內膜血流情況與容積及內膜上的激素受體、細胞因子等，這需要進一步研究。

本研究還發現在準備內膜啟動日，即月經周期3～7 d時內膜的厚度越小，臨床妊娠率反而越高，回歸分析也顯示準備內膜啟動日內膜厚度是影響HRT-FET周期妊娠結局的相關因素。檢索國內外文獻，尚未見相關研究報道。月經周期是卵泡生長發育、排卵、撤退出血，周而復始。卵巢功能好者黃體功能正常，撤退出血內膜剝離干凈，新生內膜血運豐富，生長達到移植時間窗時間較長，內膜上促進胚胎著床的各種細胞因子旺盛，從而有利于胚胎著床；而準備內膜啟動日內膜的厚度大的患者可能是相反的情況。后續需要更多的相關研究對此進行驗證。

對于HRT準備內膜中雌激素作用時長是否與妊娠結局相關，各研究結果不一。閆婭妮等[8]分析了126個HRT方案準備子宮內膜的FET周期的臨床資料，按轉化內膜日雌激素應用天數分為4組：≤21 d、22～28 d、29～35 d、36～48 d，4組間比較臨床妊娠率、早期妊娠丟失率無統計學差異；張軍等[9]將凍融胚胎移植日的周期時間分為3組，再將每組細分為自然周期組和HRT周期組，探討FET周期中胚胎移植時間對臨床妊娠率的影響，得出結論認為HRT周期組在月經周期第15天后移植有利于獲得更高的臨床妊娠率。本研究將戊酸雌二醇服用不同時長進行分組比較，10～15 d時長妊娠率較高，組間比較有統計學差異，但回歸分析未能進入方程。分析認為HRT周期準備內膜時服用戊酸雌二醇一般從月經周期第3～7天開始，服用10～15 d相當于自然周期的第14～22天，接近自然月經周期的窗口期，有利于胚胎著床。本研究結果與上述研究結論不一致，或許與樣本量較少有關。

移植胚胎質量/數量是公認影響輔助生殖技術的重要因素。本研究顯示移植D3卵裂胚和D5囊胚的單胚胎移植和雙胚胎移植組間妊娠結局比較有統計學差異，回歸分析也顯示與妊娠結局相關，移植D5囊胚比D3卵裂胚妊娠率高，且無論D3或D5胚胎移植2個均比1個胚胎妊娠率明顯增高。研究表明桑椹胚比卵裂期胚胎整倍體率高50%左右，卵裂期胚胎有高達60%的非整倍體率[10]。由于不同發育時期胚胎的整倍體率不一樣，而且相較于D3卵裂期胚胎，D5囊胚移植暴露于子宮環境的時間與自然生理狀態更接近[11]，同時只有那些發育潛能更好的卵裂期胚胎經過繼續培養才能發育成囊胚，經歷了激活胚胎基因組、融合細胞、形成以及擴大囊胚腔的過程，因此囊胚發育潛能更好[12]，故囊胚期胚胎移植的妊娠率高于卵裂期胚胎。

從“胚胎-子宮內膜對話”理論[13]觀點出發，Matorra等[14]從大數據分析認為，多個胚胎的移植促進協同產生更多孕酮及激發內膜表達有利于著床的因子，改善胚胎與內膜的同步性，從而促進新的單胚胎的種植，其研究結果認為移植胚胎數目每增加1個，新引入的胚胎的種植成功率便會增加22%。王麗娜等[15]用Logistic回歸分析2 433例胚胎解凍移植預后因素，認為移植優質胚胎數及患者年齡是影響FET結局的主要因素，而移植優質胚胎數對FET結局影響最大，移植2個或以上胚胎臨床妊娠率、胚胎種植率及活產率無明顯增加，但多胎率明顯升高。

綜上所述，在HRT-FET周期中，影響妊娠結局的主要因素包括年齡、內膜準備啟動日子宮內膜厚度、轉化日內膜厚度以及移植胚胎類型/數量；在進行HRT-FET周期的內膜準備過程中，應綜合考慮影響FET結局的各種相關因素，制定個體化的移植策略，提高妊娠率的同時，努力降低多胎率，減少母嬰并發癥。本研究是回顧性分析，受制于樣本數量和病例選擇，可能存在一定偏倚。更確切的結論尚需大規模的前瞻性研究。