難治性高精子DNA碎片指數患者的睪丸精子在ICSI周期中應用的臨床結局分析

侯開波，王喜良，杜超，劉星池，關小川，王博倫，于月新

(中國人民解放軍北部戰區總醫院生殖醫學科，沈陽 110016)

隨著生活方式的轉變，不孕癥發病率有逐年升高的趨勢，臨床發病率約10%～15%，其中與男性因素相關的不孕癥約占50%[1-2]。目前世界衛生組織評估男性生育力推薦的指標僅是男性精液的常規分析，包括精子的數量、活力和形態等，有一定的局限性。近些年精子功能檢查指標即精子的DNA完整性檢測越來越受到重視，認為精子的DNA完整性可以影響精子的自主受精能力和胚胎的發育潛力，當精子DNA碎片指數(DFI)大于20%時，即可引起自然受孕率和人工授精成功率的下降[3]，且精子的DNA損傷與體外受精的妊娠率和胚胎質量成負相關[4]。評估精子DNA完整性的較好方法是采用流式細胞術行精子DFI的檢測，通過評估精子單、雙鏈DNA的比例，評價精子DNA損傷的程度[5]。引起精子DNA完整性下降的原因較多，如睪丸后輸精管道炎性病變、高齡、精索靜脈曲張和大量吸煙酗酒不良的生活習慣等，臨床上并無特異性改善精子DNA完整性的治療方案，常用的治療措施有病因治療，如精索靜脈曲張手術治療、抗炎治療和糾正不良生活習慣等以及經驗性的抗氧化劑治療。然而部分患者經上述治療后無顯著療效。如何減少高DFI精子對生殖結局的影響一直是醫患共同關心的問題。本研究旨在觀察精子濃度正常的頑固性高DFI患者的睪丸精子對ICSI妊娠結局的影響，探索一種高DFI情況下通過改變精子來源改善ICSI臨床結局的方法。

一、資料與方法

1.研究對象：回顧性分析2018年1月至2020年9月于我院生殖醫學科因精子高DFI進行ICSI助孕的患者。納入標準：(1)精子濃度>15×106/ml，精子DFI>30%；(2)經藥物保守治療或精索靜脈曲張手術治療后3個月以上DFI無改善；(3)夫妻符合體外受精助孕指征。排除標準：患有低促性腺激素性性腺功能減退、精索靜脈曲張、染色體異常、睪丸炎、接受放療或化療等睪丸前性或睪丸性因素疾病的患者。

共納入61例患者。依據我院輔助生殖技術程序，相關治療前所有高DFI患者夫妻均已被告知DFI值對輔助生殖的影響，并簽署知情同意書，且通過我院倫理委員會審查。

2.分組：根據助孕精子獲取方式不同，分為睪丸穿刺取精組(TESA組，n=27)和手淫射精組(EJ組，n=34)。ICSI助孕前1個月檢測DFI，并再次確認DFI值。

3.精子獲取：TESA組采用睪丸細針穿刺取精術，精索阻滯麻醉后用20 ml溶藥注射器的側孔針穿刺目的睪丸，負壓抽吸睪丸曲細精管組織，由輔助生殖實驗室工作人員撕碎曲細精管，在倒置顯微鏡下查找適量活動精子備用；EJ組取精前禁欲3～7 d，取卵日手淫射精獲取精液送實驗室檢查、處理備用。

4.DFI檢測：精子DFI采用美國BD公司流式細胞儀(BD AccriC6)檢測，按照精子核完整性染色試劑盒(浙江星博生物科技)說明書操作。經吖啶橙染色后上流式細胞儀檢測熒光，應用BD Accri C6軟件進行計算；DFI(%)=綠色熒光數/(綠色熒光數+紅色熒光數)×100%。

5.卵母細胞獲取：配偶月經周期第2～3天行基礎內分泌檢查，制定促排卵方案；月經第19～23天降調節用藥，次月月經周期第2～5天行B超檢查及內分泌檢測，啟動促排卵用藥，月經第6～16天定期行B超檢查和內分泌檢測，依卵泡大小確定HCG注射日；注射HCG后34～38 h取卵。

6.胚胎質量評估：依據Scott-Z法評估胚胎質量，于第3天評估卵裂球及碎片的百分比。第3天出現≥8個卵裂球、碎片≤20%為優質胚胎。取卵后第3天進行胚胎移植。

7.臨床結局判定：胚胎移植后5周行彩超檢查，宮內見妊娠囊為臨床妊娠；移植后10周彩超檢查宮內仍有妊娠囊和胎心搏動者為持續妊娠，僅有妊娠囊者或胎心消失者為妊娠丟失。

二、結果

1.兩組患者的基本情況：本研究共61例患者納入臨床觀察，其中TESA組27例，對照EJ組34例。兩組患者間年齡、不育年限、精子濃度、DFI值、配偶年齡、配偶基礎卵泡刺激素(bFSH)值、抗苗勒管激素(AMH)值和移植日子宮內膜厚度均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的基本情況(-±s)

2.兩組患者配偶促排卵及受精情況：兩組間獲卵數、受精數和受精率均無顯著性差異(P>0.05)；TESA組胚胎數和優質胚胎數顯著高于EJ組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者配偶促排卵和受精情況[(-±s)，%]

3.兩組患者配偶妊娠結局比較：TESA組臨床妊娠率和持續妊娠率均顯著高于EJ組(P<0.05)，妊娠丟失率顯著低于EJ組(P<0.05)；TESA組的種植率高于EJ組，但差異無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者配偶妊娠結局(%)

討 論

DFI作為評估男性生育力的重要功能學指標，是對精液常規分析的有力補充，尤其對于不明原因的不育癥、不明原因反復流產和不明原因的助孕失敗等有重要的臨床指導意義。精子DFI可能通過影響受精、胚胎的早期發育和胚胎植入等方面而影響妊娠結局，但這些認識尚未得到業內學者的一致認可。

研究表明，精子DFI與精液的常規參數有一定相關性[6]。以往研究顯示，約10%～30%的不育夫妻臨床上無法找到具體病因[7]，這些不明原因不育夫妻中25%～40%男性患者伴有DFI大于20%～30%[8]，提示了精液常規分析的局限性。另外也有研究表明精子DFI大于20%即可引起不育，并且DFI值與ART助孕結局和反復妊娠早期丟失成負相關[9-11]。配偶反復妊娠丟失的患者精子活性氧水平和DFI顯著高于正常妊娠組，且高DFI水平引起精子轉錄失調影響受精卵植入后胚胎的發育[12]。Robinson等[13]薈萃分析了2 969對高DFI值行ICSI的夫婦的妊娠結局，發現高DFI值流產的風險增加了2.16倍。精子DNA完整性差的患者的睪丸精子，因沒有遭遇睪丸后生殖道炎癥、氧化應激等損傷，其DFI值較體外射精獲得的精子要低，此類患者睪丸精子行ICSI的結局更好[14-15]。張明亮等[16]通過分析重度少精子癥并高DFI值患者的ICSI臨床資料發現，此類患者采用睪丸精子行ICSI助孕，可以顯著改善胚胎的數量、質量和臨床妊娠率，而胚胎丟失顯著降低。另有學者認為DFI對男性生育力影響的大小與其配偶的卵泡質量有關，認為優質卵母細胞對精子DNA損傷有修復作用，DFI值對體外助孕技術臨床結局預測價值有限，相同的DFI值對女方卵泡質量較差的夫妻的妊娠結局影響更大[17-18]。

我們研究的數據表明：對于DFI值異常的患者，采用睪丸精子進行ICSI助孕，可以顯著改善胚胎的數量和質量，對提高臨床妊娠率和持續妊娠率、降低胚胎丟失率有顯著意義；而對受精率和種植率的影響沒有顯著性差異，與以往國內外其他學者研究的數據[16，19]一致。

影響臨床妊娠結局的因素眾多，每種因素互相聯系互相影響。所以，即使對于同樣一份高DFI精液標本，生殖專業男科、婦科醫生應根據每對夫妻的實際情況，如配偶的年齡、妊娠史及助孕史等，給出合理的個體化建議。結合既往國內外學者的研究和我們的臨床觀察，對于伴有妻子反復不明原因助孕失敗、反復不明原因早期胚胎停育和不明原因不育的夫妻，男性精子DFI值可以為助孕方式的選擇提供依據，以改善人工助孕的妊娠結局[4]。

鑒于我們的臨床觀察數據較小，精子DFI值對復雜情況下的自然妊娠或人工助孕妊娠率、妊娠結局的影響仍需要大樣本多中心隨機對照研究加以探討，以促進臨床工作中生殖中心、男科和輔助生殖實驗室等相關專業學者達成共識。