非整倍體篩查周期中發生早期妊娠丟失的影響因素分析

范英英，李蕾，李凈羽，王雪，張翠蓮

(鄭州大學人民醫院 河南省人民醫院 河南省生殖醫院，鄭州 450003)

在輔助生殖技術中，有大型數據顯示妊娠丟失率可高達18.3%[1]，其中早期妊娠丟失占50%以上[2]，早期妊娠丟失會增加患者的身體、心理以及經濟負擔[3]。目前臨床對早期妊娠丟失也有較多的研究，有文獻報道早期妊娠丟失與子宮畸形、高齡、體質量指數(BMI)、既往流產史、多囊卵巢綜合征(PCOS)、胚胎染色體異常等多因素有關[4-6]，其中以胚胎染色體異常為主要因素[4]。Murugappan等[7]發現胚胎植入前遺傳學檢測-非整倍篩查(PGT-A)周期中的流產率顯著低于常規IVF/ICSI周期。但在臨床工作中我們觀察到，經過胚胎篩選正常后植入的PGT-A患者仍有早期妊娠丟失發生，其原因不明，相關文獻報道較少。本文主要對此進行相關探討。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2017年1月至2020年6月于河南省人民醫院生殖中心行PGT-A周期的患者。納入/排除標準：行PGT-A周期后獲得可利用囊胚且凍融移植后獲得妊娠的患者；排除診斷為先天性或后天子宮畸形，或有明確影響胚胎著床的其他因素如輸卵管積水、宮腔粘連史等患者。

本研究共納入214個周期。根據最終是否持續妊娠分為持續妊娠組(n=187)和早期妊娠丟失組(n=27)。

二、研究方法

1.促排卵方案：卵巢刺激方案主要包括早卵泡期長效長方案、黃體中期短效長方案、拮抗劑方案、高孕激素狀態下促排卵治療(PPOS)方案及微刺激方案，按照我中心ICSI常規進行。

2.胚胎檢測：采用滋養外胚層細胞活檢(TEB)，抽吸5～10個細胞送檢，篩選出染色體正常可移植的囊胚。

3.凍融胚胎移植(FET)周期內膜準備：(1)自然周期，在優勢卵泡排卵后第5日移植囊胚。(2)激素替代周期：月經第2～4日給予補佳樂(拜耳，法國)每日4～6 mg，后根據子宮內膜厚度調整其用量，最大劑量為每日8 mg。取卵周期HCG注射日內膜厚度≥7 mm時，達芙通(蘇威，荷蘭)口服每日20 mg聯合雪諾同(默克雪蘭諾，德國)陰道給藥每日90 mg轉化內膜，轉化內膜后第6日進行囊胚移植。(3)降調節后激素替代周期：于月經周期第2～4日給予長效促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a，達菲林，默克雪蘭諾，德國)3.75 mg肌肉注射，注射后第14日，當達到降調標準時給予補佳樂，適時轉化內膜，轉化后第6日進行囊胚移植。

4.黃體支持：胚胎移植后維持內膜轉化時雌、孕激素用藥不變，直到移植后14 d查血β-HCG，若≥25 U/L，繼續用藥至超聲檢查到胎心后開始逐漸減量至孕10周停藥。

5.妊娠判斷：以移植術后4周陰道B超示子宮內外有妊娠囊者為臨床妊娠；發生在12周以內的流產定義為早期流產；胚胎移植后14 d血β-HCG≥25 U/L，但B超未見妊娠孕囊者為生化妊娠。早期妊娠丟失包括早期流產和生化妊娠；早期妊娠丟失率=(早期流產周期數+生化妊娠周期數)/妊娠周期數×100%。

6.囊胚評分：按照Gardner評分系統[8]進行，根據囊腔擴張程度進行分級。囊腔不足胚胎體積的50%為1級；≥50%為2級；囊腔幾乎占滿整個胚胎為3級；囊腔擴張、透明帶變薄為4級；囊胚開始從透明帶破口孵出為5級；囊胚完全孵出，脫離透明帶為6級。對處于3～6級的囊胚，進一步對內細胞團(ICM)和滋養外胚層(TE)進行評分。ICM評分：細胞數量多且分布緊密成團，突起明顯為A級；細胞數量較少且分布松散為B級；細胞數量非常少，難以辨別明顯的ICM結構則為C級。TE評分：較多的細胞形成連接緊密的上皮層為A級；較少的細胞，上皮樣結構不連續，連接松散為B級；細胞少且體積大為C級。4BB及以上囊胚定義為優質囊胚。

三、統計學方法

結 果

一、兩組患者基礎資料分析

共收集到341個PGT-A周期，FET后共有214個妊娠周期，其中27個周期為早期妊娠丟失，早期妊娠丟失率為12.62%(27/214)。繼續妊娠組與早期妊娠丟失組間基礎資料及抗β2糖蛋白抗體、抗心磷脂抗體IgM血清學免疫指標比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者基本資料[(-±s)，n(%)]

二、兩組患者促排卵及胚胎移植情況分析

持續妊娠組的移植日子宮內膜厚度高于早期妊娠丟失組，差異有統計學意義(P<0.05)，其余指標均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者的促排卵及胚胎移植情況[(-±s)，n(%)]

三、早期妊娠丟失多因素分析

將女方年齡、BMI、孕次、胚胎發育天數、移植日子宮內膜厚度、復發性流產病史納入多因素分析，結果顯示，僅移植日子宮內膜厚度對妊娠結局的影響有統計學意義(P<0.05)(表3)。

表3 早期妊娠丟失患者多因素分析

討 論

染色體異常包括結構異常和數量異常，目前認為早期妊娠丟失中以染色體異常為主要原因，其中染色體非整倍體率異常占大部分[9]。PGT-A周期可篩選出整倍染色體的胚胎。多項研究均指出女性年齡是發生胎兒染色體異常的獨立危險因素[10-11]，本研究中移植的都是經過篩選的具有正常的整倍體染色體的胚胎，發現女性的年齡并不影響早期妊娠丟失率，可能是女性年齡影響早期妊娠丟失主要是因為女性年齡影響胎兒的染色體；也有可能是獲得妊娠的患者基本情況較好，都較年輕。需要進一步累積樣本量。胎兒的染色體還有一半來自父親，有研究發現男方年齡不會影響胚胎質量及妊娠率，但隨著男性年齡的增長，早期流產率增高[12]，原因可能與男性高齡導致胚胎染色體異常相關[13]，本研究中發現男方年齡對早期妊娠丟失率無影響，同樣可能與本研究中男性都偏年輕有關。

本研究在對移植的胚胎質量及胚胎發育天數進行討論發現，早期妊娠丟失與持續妊娠組中優質胚胎占比(37.04% vs. 39.04%)、D5胚胎占比(55.56% vs. 54.01%)無顯著差異。有研究結果提示移植D5的優質囊胚的臨床結局較D6者更好，考慮可能與D6囊胚中非整倍體率相較于D5囊胚增加有關[14-15]，而本研究中移植的都是經過整倍性篩選的胚胎。成功的妊娠不僅需要好的胚胎，同時需要合適的子宮內膜。當子宮內膜厚度保持在8.7～14.5 mm范圍內時，可獲得最佳的活產率；如果子宮內膜太薄或太厚，活產率將降低。也有研究指出內膜厚度大于14 mm后，異位妊娠的發生會升高[16-17]。本研究中早期妊娠丟失組的子宮內膜厚度低于持續妊娠組(9.59 mm vs. 9.73 mm)，差異具有統計學意義(P<0.05)，是早期妊娠丟失的影響因素。目前也有研究報道發現子宮內膜厚度及胚胎植入的深度也可作為ART成功的預測指標[18-19]，這些指標對于早期妊娠的丟失是否有影響，還有待進一步的研究。

既往研究指出隨著流產次數的增加，再發流產的風險升高[20]。但既往流產次數與胚胎染色體異常是否相關仍存在爭議。一項均移植整倍體胚胎的研究顯示，流產史與持續妊娠、妊娠丟失無關[21]。本研究中兩組患者間的復發流產史占比也無顯著性差異，結果與上述研究一致。從另一個角度分析，隨著孕次和流產次數的增加，會對子宮內膜造成一定的損傷從而導致早期妊娠丟失。本研究中未顯示孕次對早期妊娠丟失產生影響，可能的原因是本研究樣本量比較小，且平均孕次為(1.74±1.81)，孕次相對較少。確切證據還需大樣本的數據進行研究探討。

肥胖是指BMI>28 kg/m2，肥胖可通過影響患者的體內的脂肪酸含量及卵子卵泡液的環境，從而影響ART助孕的臨床結局[22-23]。但也有研究指出，肥胖及超重在凍融胚胎移植周期中不會增加流產的風險[24]。本研究中移植的胚胎都經過篩選，且本研究中患者的BMI都相對較低，結果發現BMI對早期妊娠的流產率無顯著影響，與上述結論相一致。肥胖患者中PCOS的發病率也較高，PCOS是影響育齡婦女最常見的內分泌疾病之一，PCOS患者的流產風險仍在爭論之中。本研究未發現持續妊娠組與早期妊娠丟失組PCOS患者占比有顯著差異，與徐麗清等[9]研究結果相一致。

生殖免疫重要的篩查指標包括抗β2糖蛋白抗體以及抗心磷脂抗體等。近年來研究顯示，抗β2糖蛋白抗體與復發性流產有關[25]。抗心磷脂抗體是一種凝血活性物質，可影響子宮內膜的血供從而引起流產；Zhong等[26]發現抗心磷脂抗體陽性與不良妊娠結局顯著相關。但本研究中抗β2糖蛋白抗體和抗心磷脂抗體在持續妊娠組和早期妊娠丟失組間陽性占比未見顯著差異，這可能與本研究中抗β2糖蛋白抗體和抗心磷脂抗體陽性者均已接受治療有關。

綜上所述，本研究從臨床實際問題出發，對經過PGT-A胚胎篩選正常后植入卻仍發生早期妊娠丟失的患者做了相關的統計分析，表明移植日子宮內膜厚度是PGT-A周期中早期妊娠丟失的影響因素。但本研究還存在以下局限：樣本量小；流產的胚胎并未全部做流產組織檢測，PGT-A檢測正常的胚胎仍然存在嵌合體的可能。PGT-A的應用在謹慎的原則下越來越廣泛，影響其胚胎早期丟失的原因仍需進一步明確以指導臨床。