基于TCGA和GEO分析TTK在肺腺癌中的表達及臨床意義

胡旭鋼 唐夏莉 劉細幫 陳清勇

肺癌是目前世界上發病率及死亡率最高的腫瘤類型，肺腺癌（LUAD）是肺癌最常見的組織學類型［1］。近年來，針對肺癌的分子靶向治療極大地提高了患者的生存率。尋找新的生物標志物，不僅可以更精準地闡述LUAD細胞惡變的分子機制，還可為LUAD的早期診斷、療效監測、預后評估等提供參考。酪氨酸和蘇氨酸蛋白激酶（TTK）是一種雙特異性蛋白激酶，能夠磷酸化酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，是有絲分裂過程中紡錘體裝配檢查點的核心調節蛋白［2］。目前研究顯示，在結腸癌、肝癌、膽囊癌等多種腫瘤中均存在TTK的過表達，與患者的不良預后相關［3-7］。本研究擬基于公共腫瘤數據庫觀察TTK在LUAD中的表達模式及預后意義，為TTK的機制研究及臨床應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 數據獲取 通過UCSC Xena數據庫（https：//tcga.xenahubs.net）下載腫瘤基因圖譜（TCGA）中標準化的肺腺癌RNASeq3級數據及臨床病理資料［8］。最終59例正常肺上皮組織及517例肺腺癌納入研究，其中494例包含完整隨訪信息的病例納入生存分析。從基因表達綜合數據庫（GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載肺腺癌GSE31210、GSE68465和GSE75037數據集的原始微陣列mRNA表達數據及臨床資料，采用RMA方法進行歸一化后進行相關分析［9-11］。GSE31210，共20例正常肺上皮組織和226例肺腺癌組織，臨床資料包括患者的年齡、性別、腫瘤分期、吸煙史、EGFRALKKRAS突變情況及生存隨訪信息。GSE68465，共442例包含完整生存隨訪信息的肺腺癌患者，納入生存分析。GSE75037，共83對肺腺癌及對應癌旁組織納入研究，臨床資料包括患者的年齡、性別、腫瘤分期、吸煙史及EGFRKRASSTK11突變情況。腫瘤免疫評估資源（TIMER，https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）是一個利用RNA-Seq表達譜數據預測腫瘤組織中免疫細胞浸潤情況的網站［12-13］，通過Diff Exp模塊可以快速獲得TTK基因在肺腺癌等33種腫瘤組織及對應正常組織中的表達情況。人類蛋白質圖譜（HPA，https：//www.proteinatlas.org）是利用各種組學技術來繪制蛋白質在正常及腫瘤細胞、組織和器官中表達的網站［14］，在線查詢可獲得TTK蛋白（抗體編號：CAB013229）在正常肺泡上皮細胞及肺腺癌中的免疫組化染色結果。

1.2 基因富集分析 采用GSEA軟件（4.0.2版本），以TCGA數據集中肺腺癌標本為分析對象，依據TTK表達的中位值進行分組，以Hallmark基因集作為參考基因集，置換次數為1000次，將同時滿足P＜0.05和FDR＜0.25的基因集認為是顯著富集的基因集。

1.3 統計學方法 采用R軟件（3.6.1版本）和Graphpad（8.0版本）統計軟件。計量資料以（）表示，兩兩組間比較采用t檢驗，配對數據采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。篩選包含生存隨訪信息的TCGA、GSE31210和GSE68465數據集的標本，納入隨訪＞30 d的病例進行生存分析。依據TTK表達的中位值，將患者分為TTK低表達組和TTK高表達組。利用R軟件的survival和surviminer包繪制Kaplan-Meier曲線，進行log-rank檢驗；timeROC包繪制ROC曲線，計算AUC值；survival和surviminer包進行單因素及多因素Cox回歸分析，采用forestplot包繪制森林圖。根據多因素Cox回歸結果繪制列線圖，并繪制校準曲線和決策曲線來驗證列線圖模型在預后預測中的作用。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 泛癌組織中TTK的表達 通過TIMER網站的Diff Exp模塊，搜索TTK基因在33類腫瘤組織中的表達情況。TTK在包括膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳腺浸潤癌（BRCA）、膽管癌（CHOL）、結腸癌（COAD）、食管癌（ESCA）、頭頸鱗狀細胞癌（HNSC）、腎嫌色細胞癌（KICH）、腎透明細胞癌（KIRC）、腎乳頭狀細胞癌（KIRP）、肝細胞肝癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺鱗癌（LUSC）、前列腺癌（PRAD）、直腸腺癌（READ）、胃癌（STAD）、甲狀腺癌（THCA）及子宮內膜癌（UCEC）等多種腫瘤組織中的表達均顯著高于正常組織，見圖1A。皮膚黑色素瘤（SKCM）有遠處轉移的腫瘤患者，TTK的表達明顯高于無遠處轉移的腫瘤患者。結果表明，TTK在泛癌組織中存在高表達，提示可能與惡性腫瘤的發生、演進密切相關。

2.2 LUAD組織中TTK的表達 在TCGA數據集中，與正常肺上皮組織（n=59）比較，LUAD組織（n=517）中TTK mRNA的表達顯著升高（t=16.470，P＜0.001），見圖1B。在GSE31210數據集中，20例正常肺上皮組織與226例LUAD組織比較，TTK mRNA在腫瘤組織中存在顯著高表達（t=5.406，P＜0.001），見圖1C。在GSE75037數據集中，83例LUAD組織及癌旁組織配對比較，TTK mRNA在LUAD組織中過表達（t=18.690，P＜0.001），見圖1D。HPA數據庫中的免疫組化結果提示，TTK蛋白在正常肺上皮組織中弱表達，在LUAD組織中表達明顯增加，見圖1E。綜上，TTK在LUAD組織中的表達顯著高于正常肺上皮組織。

圖1 腫瘤組織與正常組織TTK表達的比較

2.3 TTK表達與LUAD患者臨床病理特征的相關性 TTK的表達與年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期、驅動基因突變狀態、KRAS突變等密切相關（P＜0.05），與患者的 ECOG 評分（P=0.052）、遠處轉移（P=0.087）、MAP2K1突變（P=0.095）、PTPN11突變（P=0.060）可能相關，見圖2。觀察TCGA、GSE31210和GSE75037三個數據集中的TTK表達與TNM分期、吸煙史及EGFR突變的關系，結果提示TNM分期越晚，TTK表達越高（P＜0.05），見圖3A；既往吸煙史患者的TTK表達明顯升高（P＜0.05），見圖3B；在GSE31210和GSE75037兩個數據集中，與EGFR野生型患者比較，EGFR突變患者的TTK表達顯著下調（P＜0.05），見圖3C。綜上，LUAD的惡性程度越高，TTK的表達隨之增加，且TTK的表達與患者的基因突變情況密切相關。

圖2 TTK表達與LUAD患者臨床病理特征的相關性

圖3 TTK表達與LUAD患者TNM分期﹑吸煙史及EGFR基因突變的相關性

2.4 TTK表達與患者預后的相關性 在TCGA、GSE31210和GSE68465三個數據集中，通過繪制Kaplan-Meier生存曲線發現，TTK表達越高，患者的總體生存率越低（P＜0.001，P=0.001，P=0.004），見圖4A；時間依賴的ROC曲線表明，TTK能夠準確預測患者的總體生存率，見圖4B；1年生存率的曲線下面積分別為0.630、0.685和0.610；3年生存率的曲線下面積分別為0.601、0.661和0.635；5年生存率的曲線下面積分別為0.570、0.724和0.610。多因素Cox回歸結果顯示，TTK是預測LUAD患者預后的獨立預后因子，見圖4C。綜上，高表達TTK的LUAD患者預后差，且TTK是預測患者預后的一個可重復的獨立預后因素。

圖4 TTK表達與患者預后的相關性

2.5 列線圖模型的構建及驗證 基于多因素Cox回歸分析的結果，在TCGA數據集中納入腫瘤大小、淋巴結轉移及TTK表達等3個獨立預后因素，構建列線圖模型，見圖5A。校準曲線結果顯示，列線圖模型能夠較準確預測LUAD患者真實的3年生存率，見圖5B。決策曲線結果表明，與單因素預測比較，列線圖模型能更準確地反應患者預后情況，見圖5C。綜上，聯合TTK、腫瘤大小和淋巴結轉移的列線圖模型，能更準確地預測LUAD患者的預后。

圖5 列線圖模型的構建及驗證

2.6 TTK的功能基因集富集 TTK高表達的LUAD患者在細胞增殖相關通路如有絲分裂紡錘體形成通路和G2M檢查點通路、E2F靶點通路、mTOR信號通路、Myc信號通路、糖酵解通路及DNA損傷修復等信號通路富集，可能參與TTK促進LUAD演進的過程。見圖6。

圖6 TTK高表達LUAD患者的富集信號通路分析

3 討論

在腫瘤研究領域，大數據已經成為最新的驅動力，數據驅動型研究逐漸成為腫瘤生物信息學研究的重要模式，高通量測序分析技術所產生的腫瘤生物信息學數據，是腫瘤大數據的主要來源之一［15］。腫瘤生物信息學數據具有質控規范、資源共享、海量樣本、超高數據維度等特點，對研究腫瘤發生、演進及治療具有重要意義［16-17］。在惡性腫瘤的病理診斷、藥物篩選、個體化基因型與表型構建、預后預測等方面，基于大數據分析的人工智能和機器學習都已取得了飛速的發展［17-18］。運用大數據挖掘技術探究腫瘤的本質是今后腫瘤研究領域的重要方法。

有絲分裂是一個高度精確有序的過程，紡錘體裝配檢查點在監督細胞正確分裂過程中發揮重要作用。TTK作為紡錘體裝配檢查點的核心組分，只有當染色體正確連接時，有絲分裂才能順利進入后期，否則阻滯與M期［19］。因此，TTK在高增殖指數的細胞中明顯升高，如正常睪丸及胎盤組織，以及在惡性腫瘤組織中高表達［20-21］。本研究通過多組學、多中心的數據比較發現，TTK在包括LUAD在內的泛癌組織中存在明顯高表達，并與LUAD的惡性表型及不良預后明顯相關，聯合TTK表達及腫瘤大小、淋巴結轉移等臨床特征，可以準確的預測患者的總體生存時間，為后續的TTK相關細胞及機制研究提供了良好的基礎。

流行病學調查結果提示，約90%肺癌的患者均存在不同程度的煙草暴露，煙草暴露人群的肺癌發病風險較無暴露人群提高了近30倍［22］。本研究發現，在既往有煙草暴露史的LUAD患者中，TTK的表達明顯升高，而相比于EGFR突變的患者，EGFR野生型的患者中TTK表達顯著增加。這些結果提示TTK可能成為煙草暴露患者，尤其是EGFR野生型患者的有效治療靶點，與腫瘤的惡性表型及不良預后密切相關，可作為預后監測及藥物治療的新標志物。