大蒜素對不同濃度LPS作用下人牙周膜成纖維細胞炎癥因子表達的影響

謝靜 林湘林 林芝 丁熙

慢性牙周炎（CP）是菌斑微生物引起的牙周支持組織進行性破壞的炎癥性疾病，脂多糖（LPS）在發病過程中起重要作用［1］，其通過腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）等促炎因子和在細胞外基質降解過程中起關鍵作用的基質金屬蛋白酶（MMPs）［2］啟動聯級反應，進而引起牙周組織的損傷及基質纖維的降解。大蒜素對多種口腔疾病具有良好療效［3］，其在牙周基質組織的形成過程中可起重要作用［4］。本研究采用不同濃度LPS作用于hPDLCs，加入6 μg/ml大蒜素，觀察大蒜素對不同程度牙周炎的抗炎及抗基質降解的作用，為臨床上使用大蒜素治療牙周炎提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑 大蒜素（3 mg/ml）購自山東魯抗辰欣藥業有限公司，LPS購自Sigma公司，DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自Gibco公司，抗波形絲蛋白單克隆抗體、角蛋白單克隆抗體、Human total MMP-1 ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 組織來源 收集于本院口腔科就診患者因正畸而拔除的無齲壞牙、無牙周疾病的前磨牙和阻生牙，刮取根中1/3牙周膜用于細胞培養。供牙者年齡12～20歲，無結締組織疾病，未全身應用皮質類固醇等藥物，均知情同意。

1.3 研究方法 （1）hPDLCs體外培養：采用組織塊貼壁法，倒置顯微鏡下觀察細胞形態，免疫組化法進行細胞鑒定，酶消化法常規傳代，取第5代細胞用于實驗。（2）分組：四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）測定細胞活性，10 cm培養皿中培養24 h。根據LPS濃度及大蒜素濃度分組，每組設6復孔，具體如下：①空白對照組：含2%胎牛血清的DMEM培養液；②調零對照組：6 μg/ml大蒜素+含2%胎牛血清的DMEM培養液；③0.1 μg/ml LPS組：0.1 μg/ml LPS+含2%胎牛血清的DMEM培養液；④0.1 μg/ml LPS+6 μg/ml大蒜素組：0.1 μg/ml LPS+6 μg/ml大蒜素+含2%胎牛血清的DMEM培養液；⑤1 μg/ml LPS組：1 μg/ml LPS+含2%胎牛血清的DMEM培養液；⑥1 μg/ml LPS+6 μg/ml大蒜素組：1 μg/ml LPS+6 μg/ml大蒜素+含2%胎牛血清的DMEM培養液；⑦10 μg/ml LPS組：10 μg/ml LPS+含2%胎牛血清的DMEM培養液；⑧10 μg/ml LPS+6 μg/ml大蒜素組：10 μg/ml LPS+6 μg/ml大蒜素+含2%胎牛血清的DMEM培養液。（3）大蒜素對不同濃度LPS誘導的hPDLCs分泌TNF-α、IL-1β及MMP-1的含量測定：取生長狀態良好的第5代細胞以2×105/孔接種于96孔板，在溫度37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養24 h，棄原培養液，使用無菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3次，按上述分組方案加藥，37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養48 h，之后收集培養液，采用ELISA試劑盒檢測各組TNF-α、IL-1β及MMP-1的含量，于550 nm處讀取酶標儀上的吸光度值（OD值），并通過標準曲線獲得待測樣本各指標的濃度值。各LPS濃度下，各指標的抑制率=（1-觀察組值/對照組值）×100%。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以（）表示，進行雙尾檢驗。采用析因設計的方差分析比較各組數據的統計學差異，單獨效應分析采用One-way ANOVA，組間兩兩比較采用Bonferroni法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組TNF-α表達情況比較 見表1。

表1 各組TNF-α表達情況比較［pg/ml，（）］

表1 各組TNF-α表達情況比較［pg/ml，（）］

LPS（μg/ml） 0 0.1 1 10大蒜素 0 15.59±1.1938.65±4.5186.12±9.37106.13±8.0412.333 ＜0.001 6 17.34±1.0833.46±4.0765.02±5.85 75.74±5.28 14.330 ＜0.001抑制率（%） -11.22 13.43 24.50 28.63 F值 7.119 4.373 21.884 59.930 P值 0.024 0.063 0.001 ＜0.001組別F值 P值作用濃度

2.2 各組IL-1β的表達情況比較 見表2。

表2 各組IL-1β的表達情況比較［pg/ml，（）］

表2 各組IL-1β的表達情況比較［pg/ml，（）］

LPS（μg/ml） 0 0.1 1 10大蒜素 0 11.71±2.0431.18±4.81 74.01±4.65104.78±8.75336.726 ＜0.001 6 14.47±2.7528.65±3.39 57.67±4.07 70.99±6.10 221.968 ＜0.001抑制率（%） -23.57 8.11 22.08 32.25 F值 3.913 1.113 41.919 60.274 P值 0.076 0.316 ＜0.001 ＜0.001組別F值 P值作用濃度

2.3 各組MMP-1表達情況比較 見表3。

表3 各組MMP-1表達情況比較［ng/ml，（）］

表3 各組MMP-1表達情況比較［ng/ml，（）］

LPS（μg/ml） 0 0.1 1 10大蒜素 0 29.08±2.1157.67±3.5380.01±4.1698.42±8.03 10.510 ＜0.001 6 30.78±2.3648.95±5.6361.15±3.8071.61±5.03 95.927 ＜0.001抑制率（%） -5.85 15.12 23.57 27.24 F值 1.741 10.338 67.346 48.061 P值 0.216 0.009 ＜0.001 ＜0.001組別F值 P值作用濃度

3 討論

研究發現，在患有嚴重牙周附著喪失及牙槽骨吸收的牙周炎患者的牙周組織中，TNF-α、IL-1β的表達明顯升高，表明其在炎癥中發揮關鍵作用［5］。TNF-α作為主要的促炎因子之一，可刺激機體產生多種炎癥因子，并誘導破骨細胞成熟、促進骨組織吸收破壞，從而導致疾病進展［6］。在TNF-α拮抗劑的作用下，齦溝液中TNF-α的表達明顯降低，牙齦炎癥狀況可得到改善［7］。此外，IL-1β也是牙周炎中的關鍵細胞因子，可趨化炎癥細胞及相關因子在炎癥區域聚集浸潤，促進破骨效應，誘導骨質流失，促進牙周炎進展。有研究顯示，牙周炎患者深部牙周袋中IL-1β濃度明顯升高，而在有效治療后其濃度明顯下降［8］。MMPs是一種可降解細胞外基質的蛋白水解酶，可通過直接降解膠原蛋白或激活纖溶蛋白酶級聯反應破壞結締組織，是牙周炎進展的重要因子。MMP-1是成纖維細胞型膠原酶，可特異性降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原，參與有機基質和膠原纖維的降解。

筆者前期有研究大蒜素對LPS作用下hPDLCs膠原代謝的影響，發現6 μg/ml濃度的大蒜素對細胞的刺激較小，降低LPS對hPDLCsⅠ型膠原合成及分泌的抑制作用的效果也較明顯［4］，故本研究觀察組的大蒜素濃度設定為6 μg/ml。本研究結果顯示，在未添加大蒜素的情況下，隨著LPS濃度的逐漸增高，TNF-α、IL-1β及MMP-1的表達也呈增高趨勢，提示不同濃度LPS對hPDLCs具有不同程度的炎癥刺激作用，一定范圍內較高濃度的LPS刺激產生炎癥因子的能力較強。同時LPS作用于hPDLCs后也可促進MMP-1的分泌，分泌程度也呈LPS濃度依賴性。在添加6 μg/ml大蒜素后，雖然LPS濃度越高，TNF-α、IL-1β及MMP-1的增高趨勢未變，但總體上與未添加大蒜素時相比均有所下降。在0.1 μg/ml LPS作用下，6 μg/ml大蒜素組與未添加大蒜素組比較，TNF-α、IL-1β及MMP-1均有所下降，但TNF-α、IL-1β差異無統計學意義，提示6 μg/ml大蒜素對低濃度LPS刺激下的hPDLCs抑制炎癥因子作用不明顯。在1 μg/ml、10 μg/ml LPS作用下，6 μg/ml大蒜素組與未添加大蒜素組比較，TNF-α、IL-1β及MMP-1均有較大幅度的下降，三者差異均有統計學意義，并且10 μg/ml LPS作用下6 μg/ml大蒜素對三者的抑制率高于1 μg/ml LPS作用下6 μg/ml大蒜素對三者的抑制率。以上結果提示，6 μg/ml大蒜素對較高濃度LPS刺激下的hPDLCs抑制炎癥因子及MMP-1作用較明顯，且在一定范圍內LPS濃度越高，其抑制的效率也越高；與輕度牙周炎患者相比，大蒜素針對中、重度牙周炎患者可能具有更好的抗炎及抗基質降解作用。值得注意的是，在無LPS刺激的情況下，6 μg/ml大蒜素組與未添加大蒜素組比較，TNF-α、IL-1β及MMP-1均有所增高，雖然僅TNF-α差異有統計學意義，但此結果是否提示大蒜素本身的刺激對hPDLCs具有促炎及促基質降解作用，尚需進一步的研究探討。

綜上，不同濃度LPS作用于hPDLCs后可促進TNF-α、IL-1β及MMP-1的分泌，分泌程度呈LPS濃度依賴性。6 μg/ml大蒜素對不同濃度LPS刺激下的hPDLCs炎癥因子及MMP-1具有抑制作用，其抑制效率在一定范圍內與LPS濃度成正比，提示大蒜素對中、重度牙周炎患者可能具有更好的抗炎及抗基質降解作用。