三七藥酒對大鼠佐劑性類風濕關節炎的藥效評價

陳玲芳 邵敬寶 印曉紅 沈煒 普俊勇 姚建標 陳燁 張利竣 石楠 石森林

三七藥酒是云南希陶綠色藥業股份有限公司生產（國藥準字Z53021182），由三七、紅花、大血藤、乳香、沒藥、醋延胡索、醋香附、四塊瓦和蘇木等藥物組成，具有舒筋活絡、散瘀鎮痛、祛風除濕、強筋壯骨等功效，臨床用于治療跌打損傷，風濕骨痛，四肢麻木等癥。本研究選擇佐劑性類風濕關節炎大鼠模型綜合評價三七藥酒治療類風濕性關節炎的藥效作用，為三七藥酒治療類風濕性關節炎（RA）的臨床研究提供藥效學實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar雄性大鼠60只，體質量（180±20）g，浙江中醫藥大學動物實驗中心代購，動物生產許可證號：SYXK（浙）2013-0184。飼養環境：12 h光照，12 h黑暗，溫度20～22℃，濕度45%～65%。

1.2 藥物與試劑 基酒（批號20170305）由浙江康恩貝制藥股份有限公司提供，三七藥酒（批號171018）由云南希陶綠色藥業股份有限公司提供，雷公藤多苷片（批號1607102B）購自浙江得恩德制藥有限公司，完全弗氏佐劑（10 mg/ml BCG）購自sigma公司。

1.3 儀器 足趾容積測量儀（山東醫學科學院設備站），自動染色機（Leica），RM2245切片機（Leica）。

1.4 造模與給藥 60只大鼠適應性喂養3 d后，稱重，剔除體質量＞220 g或＜160 g的大鼠，剩余的按照隨機數字法分為七組，即空白組、模型組、基酒組、雷公藤多苷組、三七藥酒低劑量組、三七藥酒中劑量組、三七藥酒高劑量組，每組各8只?？瞻捉M大鼠右后足底皮內注射0.1 ml氯化鈉注射液，其余大鼠右后足底皮內注射0.1 ml完全弗氏佐劑，注射后用手指按壓針孔20 s［1］。于造模當天開始，分組灌胃給藥，記錄為D1，給藥期間正常飲食。空白組、模型組灌胃純化水，基酒組灌胃基酒，雷公藤多苷組灌胃雷公藤多苷混懸液（1.5 mg/kg），三七藥酒低劑量組灌胃基酒稀釋的三七藥酒（3 ml/kg），三七藥酒中劑量組灌胃基酒稀釋的三七藥酒（6 ml/kg），三七藥酒高劑量組灌胃三七藥酒原液（9 ml/kg）。灌胃劑量按大鼠體重0.4 ml/100 g，1次/d。

1.5 觀察指標 （1）大鼠體重：分別于造模前1天（D0）、造模后每2天的給藥前、末次給藥后（D21）以及禁食不禁水＞12 h后的D22進行稱重。（2）大鼠足跖容積測定：采用大鼠足跖容積測量儀，測量深度以踝關節毛際線處為標準，分別于造模D1的造模前、之后每兩天的給藥前進行，D21末次給藥前為最后一次測定。（3）大鼠痛閾測定：分別于造模D1、以后每2天的給藥前，D21末次給藥前為最后一次，取大鼠右后足趾中部，采用大鼠電子壓痛測量儀進行足趾壓痛值測定。（4）大鼠足踝周長測定：于造模第13 d開始，之后每兩天給藥前，D21末次給藥前為最后一次，用軟尺測定大鼠右后足踝最腫部位的周長。（5）大鼠踝關節HE染色：大鼠處死后，截取患側踝關節，除去足部皮膚，以及多余筋膜和肌肉，浸泡于10% EDTA液中脫鈣，行HE染色，電鏡下觀察踝關節的病理變化。

1.6 統計學方法 采用SPASS 17.2統計軟件。各個檢測指標的樣本均數以（）表示，采用多個樣本均數的方差分析，進行q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量比較 見表1。

表1 各組大鼠體質量比較［g，（）］

表1 各組大鼠體質量比較［g，（）］

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與基酒組比較，×P＜0.05；與雷公藤多苷組比較，●P＜0.05

組別 空白組 模型組 基酒組 雷公藤多苷組 三七藥酒低劑量組 三七藥酒中劑量組 三七藥酒高劑量組D0 177.06±6.56 174.01±8.47 176.55±6.41 171.50±6.51 178.36±6.07 171.93±5.61 171.43±7.00 D2 183.43±9.13 168.54±7.69* 172.15±6.85* 171.14±6.23* 177.21±7.27 ＃ 168.04±11.55* 166.74±6.59*D4 187.38±10.81 170.02±6.16* 168.55±7.09* 175.13±7.27* 178.00±13.45*× 166.61±10.45* 166.04±6.92* ●D6 194.44±10.13 169.54±7.48* 161.51±5.91* 172.20±5.17*× 175.29±10.58*× 162.03±16.33*● 160.83±8.88*●D8 204.14±11.92 170.01±6.49* 163.64±5.26* 173.31±4.79*× 172.05±15.09* 165.69±14.21* 163.63±6.81* ●D10 209.88±12.24 173.73±5.78* 163.19±9.17*＃ 177.68±5.20*× 177.18±13.65*× 169.70±12.97* 167.49±6.12*●D12 217.06±10.94 175.88±6.13* 167.33±7.56* 180.85±6.14*× 180.29±11.81*× 174.41±12.86* 170.63±7.12*●D14 226.96±11.65 178.13±7.85* 168.88±9.34* 181.63±5.41*× 184.95±12.09*× 177.85±12.08* 172.71±6.16*D16 236.41±11.47 181.88±9.04* 173.66±7.53* 186.71±6.18*× 189.96±11.86*× 183.36±12.79*× 178.86±6.04*D18 242.56±11.64 188.23±12.58* 177.18±10.46* 191.86±6.48*× 195.25±13.43*× 190.36±14.05*× 182.26±5.61*D20 250.73±11.73 196.40±12.31* 183.23±9.48*＃ 198.10±5.93*× 202.56±13.90*× 197.05±12.34*× 190.35±6.18*×D22 243.60±9.93 190.50±11.36* 182.13±9.51* 195.35±7.27*× 201.69±13.80*＃ × 194.16±12.75*× 186.54±7.71*

2.2 各組大鼠足跖容積比較 見表2。

表2 各組大鼠足跖容積比較［ml，（）］

表2 各組大鼠足跖容積比較［ml，（）］

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與基酒組比較，×P＜0.05；與雷公藤多苷組比較，●P＜0.05

組別 空白組 模型組 基酒組 雷公藤多苷組 三七藥酒低劑量組 三七藥酒中劑量組 三七藥酒高劑量組D1 1.19±0.17 1.16±0.13 1.21±0.17 1.19±0.08 1.13±0.06 1.15±0.12 1.15±0.11 D3 1.23±0.15 2.22±0.20* 2.41±0.17* 2.46±0.27* 2.25±0.16*● 2.07±0.15*＃ × ● 2.17±0.22*× ●D5 1.23±0.09 3.07±0.10* 2.89±0.36* 2.88±0.17* 2.93±0.28* 2.68±0.21* ＃ × 2.87±0.21*D7 1.27±0.11 3.81±0.26* 3.76±0.45* 3.94±0.27* 3.62±0.28* 3.14±0.47* ＃ × ● 3.44±0.45* ?！馜9 1.33±0.06 3.94±0.34* 3.96±0.26* 3.91±0.38* 3.27±0.55*＃×● 3.32±0.23*?！痢?3.44±0.42*＃×●D11 1.25±0.15 3.86±0.34* 3.85±0.44* 3.68±0.35* 3.20±0.39*?！痢?3.16±0.31*?！痢?3.16±0.41*?！痢馜13 1.31±0.10 4.19±0.43* 3.94±0.61* 3.74±0.33*＃ 3.57±0.30*＃ 3.19±0.45*?！痢?3.31±0.44*?！痢馜15 1.40±0.10 4.00±0.48* 3.73±0.42*＃ 3.98±0.32* 3.61±0.30*?！?3.02±0.27*?！痢?3.22±0.41*＃×●D17 1.37±0.10 4.08±0.26* 3.55±0.51*＃ 3.94±0.23*× 3.44±0.40*＃● 3.09±0.21*＃ × ● 3.38±0.42*?！馜19 1.42±0.10 3.92±0.39* 3.67±0.39*＃ 3.80±0.38* 3.33±0.29*?！痢?2.87±0.28*＃×● 3.22±0.25*＃×●D21 1.37±0.15 3.82±0.11* 3.87±0.43* 3.76±0.32* 3.24±0.21*?！痢?2.84±0.25*?！痢?3.12±0.28*＃×●

2.3 各組大鼠痛閾值變化情況比較 見表3。

表3 各組大鼠痛閾值變化情況比較［g，（）］

表3 各組大鼠痛閾值變化情況比較［g，（）］

注：表示與空白組比較，差異有統計學意義 *P＜0.05；表示與模型組比較，差異有統計學意義＃P＜0.05；表示與基酒組比較，差異有統計學意義 ×P＜0.05；與雷公藤多苷組比較差異有統計學意義 ● P＜0.05

空白組 模型組 基酒組 雷公藤多苷組 三七藥酒低劑量組 三七藥酒中劑量組 三七藥酒高劑量組D1 256.76±46.95 221.87±32.35 239.11±27.37 229.30±40.18 258.68±50.27 259.93±52.79 245.96±30.51 D3 261.91±35.18 163.62±29.65* 171.74±41.83* 158.45±47.99* 173.30±33.06* 141.24±25.59* 143.68±31.29*D5 307.95±57.03 139.84±27.15* 150.84±28.45* 163.51±32.98* 173.68±34.87*※ 139.71±20.83* 157.80±30.60*D7 330.25±66.52 156.28±24.22* 135.51±23.36* 166.45±29.96* 173.43±24.12*× 171.47±35.80* 186.84±49.58*×D9 403.95±70.71 143.23±30.59* 161.75±27.76* 195.40±28.40*＃ 183.29±30.24*＃ 157.03±24.55*● 177.95±35.76*D11 361.61±71.17 127.48±29.53* 126.14±17.23* 154.98±32.17* 160.76±25.00* 163.13±42.28* 173.00±30.54* ＃ ×D13 374.98±76.78 133.55±33.45* 136.91±30.58* 154.95±32.47* 177.05±34.73* ＃ × 151.78±29.49* 162.75±29.85*D15 398.63±57.68 115.58±13.88* 121.51±26.76* 155.00±35.20*＃ 158.81±35.51*?！?160.71±26.44*＃× 171.28±33.91*?！罝17 394.14±58.02 127.99±25.85* 119.53±19.66* 169.85±36.37*＃ × 160.48±35.49*× 164.45±29.81*＃ × 163.33±33.76*＃ ×D19 411.33±53.40 125.75±23.02* 126.90±25.09* 155.74±40.78* 157.58±30.45*＃ 170.88±22.26*＃ × 170.48±22.98*＃ ×D21 417.20±37.95 133.38±19.81* 122.85±21.49* 152.33±25.14*× 159.05±27.79*× 170.71±27.37*＃ × 168.48±19.81*＃ ×

2.4 各組大鼠裸關節周長比較 見表4。

表4 各組大鼠裸關節周長比較［cm，（）］

表4 各組大鼠裸關節周長比較［cm，（）］

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與基酒組比較，×P＜0.05；與雷公藤多苷組比較差異有統計學意義 ●P＜0.05

空白組 模型組 基酒組 雷公藤多苷組 三七藥酒低劑量組 三七藥酒中劑量組 三七藥酒高劑量組D13 2.22±0.05 4.28±0.11* 4.32±0.15* 4.22±0.14* 4.05±0.11*?！痢?3.92±0.10*?！痢?3.94±0.16*＃×●D15 2.23±0.11 4.31±0.17* 4.24±0.07* 4.30±0.23* 4.06±0.16*?！痢?3.96±0.10*＃×● 4.12±0.22*?！馜17 2.25±0.09 4.31±0.23* 4.34±0.18* 4.22±0.27* .99±0.26*?！痢?4.00±0.09*?！痢?4.06±0.10*?！罝19 2.30±0.11 4.18±0.22* 4.09±0.21*＃ 4.00±0.18*＃ 3.92±0.21*＃× 3.86±0.15*?！?3.95±0.12*?！罝21 2.25±0.07 3.99±0.09* 4.13±0.29* 4.02±0.27* 3.77±0.20*＃×● 3.72±0.19*?！痢?3.87±0.13*×

2.5 各組大鼠踝關節病理變化 空白組大鼠踝關節組織學結構正常，胞漿紅染，細胞形態正常；模型組大鼠關節滑模增生，有大量炎性細胞侵潤，胞漿嗜酸性增強；基酒組大鼠關節滑模增生，有大量炎性細胞侵潤，胞漿嗜酸性增強，可見較多免疫沉淀物；雷公藤多苷組關節滑模增生較模型組減輕，可見炎性細胞侵潤；三七藥酒低劑量組滑膜增生與雷公藤多苷組相當，偶見炎癥細胞侵潤；三七藥酒中劑量組滑膜增生與雷公藤多苷組相當，偶見炎癥細胞侵潤；三七藥酒高劑量組滑膜增生較三七藥酒中劑量組嚴重，炎癥細胞侵潤較三七藥酒中劑量和低劑量組嚴重。病理改變見圖1。

圖1 各組大鼠踝關節HE染色（×100）

3 討論

類風濕性關節炎（RA）是一種自身免疫性疾病，其發病原因及機制十分復雜。一般認為，RA是遺傳易感者在某種特殊環境因素的激發下，啟動由自身反應性T 細胞介導的自身免疫反應，進而引起一系列炎癥、免疫反應和關節滑膜的增生，最終導致滑膜炎、關節破壞和全身器官受損［2-4］。

AA模型是由Pearson在20世紀50年代創立的一種免疫性關節炎動物模型。AA模型的發病特點、關節疼痛、腫脹和病理改變、骨質破壞和滑膜增生等與臨床上患者RA病理學改變相似，經過多次改良，已成為目前篩選研究治療RA藥物較為理想的動物模型之一［5］。AA模型的發病原理主要是分子模擬理論。AA免疫是T細胞介導的慢性全身性炎癥反應，其中輔助性T細胞（Th）中T細胞亞群之間的平衡紊亂是AA大鼠免疫功能異常的重要特征之一。

三七總皂苷具有活血化淤的作用。姜輝等［6］研究發現，三七總皂苷對AA大鼠具有一定的保護作用，其機制可能與調節細胞因子的產生有關。顧超蘭等［7］研究發現，紅花的有效成分紅花黃色素能顯著緩解佐劑型關節炎大鼠的關節炎癥，其機制與下調炎癥因子IL-1β及TNF-α的表達有關。付鈺等［8］研究發現，中藥大血藤可抑制AA大鼠滑膜細胞分泌MMP-2、MMP-9，減輕其參與或介導的對滑膜組織造成的損害，控制滑膜炎癥的發生。李小敏等［9］研究蘇木醇提取物對類風濕性關節炎（RA）的治療作用，發現蘇木醇提取物可以減輕佐劑關節炎大鼠的足趾腫脹。本研究進一步證實，三七藥酒具有良好的消腫、減痛和促進踝關節黏膜修復的藥效作用，其作用機制可能是通過抑制炎癥細胞的分泌、減少炎性細胞浸潤而發揮鎮痛、抗炎作用，通過抑制關節滑膜增生來保護關節滑膜組織，但三七藥酒高劑量組的病理結果尚不理想，故需進一步研究探討。