基于地標點法的綏芬河絨螯蟹種群鑒定

姜曉東，成永旭，楊雨虹，吳旭干

( 1.上海海洋大學，農業農村部淡水種質資源重點實驗室，上海 201306； 2.上海海洋大學，水產動物遺傳育種上海市協同創新中心，上海 201306； 3.東北農業大學 動物科學技術學院，黑龍江 哈爾濱 150036； 4.上海海洋大學，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306 )

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)與日本絨螯蟹(E.japonicus)同屬甲殼綱、方蟹科、絨螯蟹屬，是我國經濟價值較高的蟹類[1]。中華絨螯蟹在中國的分布范圍較廣，于福建閩江及其以北的長江、黃河、遼河、甌江和圖們江等流域的沿海河流湖泊中均有分布，其中長江流域中華絨螯蟹在池塘養殖條件下具有生長快、成蟹規格大和品質高等優點，是我國最主要的養殖群體[2-3]。此外，20世紀初被偶然帶入德國的中華絨螯蟹在海外大量繁殖并形成了數量龐大的種群，隨著分布范圍不斷擴大，目前歐洲大陸和北美洲大陸各水域也存在中華絨螯蟹的分布[4-5]。日本絨螯蟹在我國的分布范圍有限，僅分布于我國廣西、廣東、福建和臺灣等沿海省份，但日本絨螯蟹在朝鮮西岸及日本沿岸的各大河流及淺海中分布量較大，在日本本土擁有重要的經濟價值[6-7]。

綏芬河是流經中國東北地區和俄羅斯濱海邊疆區的一條跨界河流，發源于中國吉林省東部，流經黑龍江省東寧市，最后于俄羅斯濱海邊疆區南部(符拉迪沃斯托克)注入日本海的阿穆爾灣。據報道，綏芬河自古便擁有豐富的絨螯蟹野生資源，人們普遍認為綏芬河流域野生絨螯蟹為從日本海溯游至中國境內的日本絨螯蟹，但有關該流域絨螯蟹屬何種絨螯蟹的相關研究較少[8]。王武等[9]曾比較長江、合浦、綏芬河和遼河4水系絨螯蟹的形態特征差異，但所用綏芬河個體為取自俄羅斯符拉迪沃斯托克并移至遼寧省盤錦市的人工繁殖后代，并非是中國境內綏芬河絨螯蟹的野生原代，故參考價值有限。為充分利用綏芬河流域的絨螯蟹野生資源，當地養殖戶在政府的支持下將綏芬河野生絨螯蟹親本運輸至人工土池生態育苗技術較為成熟的遼河流域用于交配繁殖，且已取得較好的效果[10-11]。但潛在危險不容忽視，如果綏芬河流域絨螯蟹的確為日本絨螯蟹，其所產子代逃逸至遼河流域無疑將會導致遼河水系中華絨螯蟹的種質混雜，從而導致1齡早熟率升高、商品蟹規格變小和抗病力下降等現象發生[12]。因此，通過簡捷有效的方法確認綏芬河絨螯蟹與其他地理種群絨螯蟹的親緣關系顯得尤為重要。

地標點幾何形態測量法是指先選取具有明顯特征且容易辨識的點并采集信息，后用軟件分析組間差異，具有同源性、易于采集數據和易于分析等優點[13]。近些年來，地標點法在水生動物形態的研究中得到普遍應用，其中以甲殼類和軟體動物為代表的無脊椎動物和以魚類為代表的脊椎動物的研究最為廣泛[14]。就絨螯蟹而言，地標點法已成功用于長江水系不同產地中華絨螯蟹以及不同水系中華絨螯蟹的種群鑒別[15-16]。鑒于此，筆者以絨螯蟹頭胸甲作為研究對象，以地標點幾何形態測量法作為形態特征分析方法，探討綏芬河絨螯蟹與以長江水系絨螯蟹為代表的中華絨螯蟹以及與以我國合浦和日本本土絨螯蟹為代表的日本絨螯蟹的形態特征差異，以期為綏芬河絨螯蟹的資源利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2017年9—11月于黑龍江省牡丹江市、江蘇省鎮江市、廣西省北海市和日本兵庫縣的天然水域中采集野生絨螯蟹，每一地理種群隨機采集性成熟且四肢健全的雌、雄樣本各15只。各水系絨螯蟹的采集時間、采集地點以及平均體質量等信息見表1。

表1 不同種群絨螯蟹樣品采集信息表

1.2 幾何形態測量分析

1.2.1 地標點的建立與提取

將處理好的頭胸甲放置于翻拍架上，用Nikon D300單反相機進行拍攝。相機固定于翻拍架防止抖動，在相機和翻拍架上均放置水平儀，以保證鏡頭和拍攝面完全垂直。拍攝時鏡頭與樣品間的距離保持約30 cm，頭胸甲放置于成像區域的正中位置，使鏡頭同樣與頭胸甲垂直。在相同目鏡物鏡倍數下拍攝取得頭胸甲形態的二維影像后，利用tpsDig2軟件對頭胸甲進行數字化標點(圖1)，并建立地標點數據文件。

1.2.2 平均形與薄板樣條分析

用tpsRelw軟件疊印出地標點分布情況, 對每個樣本的地標點進行平移置中、旋轉和縮放，計算所有樣本地標點的平均坐標，得到平均形。根據平均形進行局部扭曲和相對扭曲主成分分析，并保存軟件生成的相對扭曲得分(RW)矩陣和分析報告用于后續分析。利用tpsRegr軟件進行薄板樣條分析，解析地標點差異，以可視化圖例的方式來展示頭胸甲的變異部位。

1.2.3 判別分析與聚類分析

利用各樣本的相對扭曲得分，采用歐氏距離的未加權組內平均法進行系統聚類分析，采用Bayes方法進行逐步判別分析，分析軟件為SPSS 24.0。

圖1 絨螯蟹頭胸甲的地標點位置[16]Fig.1 Landmark locations on the carapace of mitten crab

2 結果與分析

2.1 主成分分析

相對扭曲主成分分析共提取了12個主成分，其中雌、雄個體第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)的累積貢獻率均超過50.00%(分別為54.17%和59.39%)，說明第1和第2主成分可以概括不同水系之間主要的形態特征差異(表2)。從第1和第2主成分繪制的散點圖可以看出，無論雌體還是雄體，長江群體與綏芬河群體部分重疊并形成較為集中的一塊區域，說明這兩群體形態特征較為接近。此外，日本群體與合浦群體無散點重疊且形成另外一塊較為集中的區域，這說明相對于長江群體與綏芬河群體而言，日本群體與合浦群體形態特征更為接近(圖2)。

2.2 差異可視化分析

利用tpsRelw軟件根據地標點數據文件計算的平均形和重疊后的效果見圖3，通過tpsRegr軟件進行扭曲、回歸分析和置換檢驗后的網格圖見圖4。通過比較平均形與各水系網格圖可以發現，各水系之間存在差異的形態特征主要為頭胸甲額刺和側刺的位置。

表2 相對扭曲得分主成分的特征值和累積貢獻率 %

圖2 不同地理種群絨螯蟹形態特征的第1和第2主成分散點示意Fig.2 Scatter plots of PC1 and PC2 of wild mitten crab from different populationsSF.綏芬河；YZ.長江；HP.合浦；JP.日本；下同.SF.Suifen River; YZ.Changjiang River; HP.Hepu; JP.Japan; et sequentia.

圖3 不同群體絨螯蟹頭胸甲的平均形和疊加示意Fig.3 Mean shape and vectorization of landmarks on carapace of wild mitten crab from different populations

2.3 判別分析

用SPSS進行逐步判別分析時，分別從雌雄個體的相對扭曲得分中篩選出對判別貢獻率較大的4個變量建立判別方程，用于各水系絨螯蟹的初步判別，判別方程系數見表3。建立判別方程后，將事先測量的指標代入上述判別公式判斷所屬群體，逐步判別分析的結果見表4。結果顯示，綏芬河、長江、合浦和日本的各30只絨螯蟹樣本中，僅個別綏芬河和長江群體絨螯蟹受到誤判，判別準確率為87%～93%，而合浦和日本絨螯蟹雌、雄個體未發生誤判，判別準確率均為100%。

2.4 聚類分析

采用歐式距離系數、最短距離法構建的聚類圖見圖5。無論雌體還是雄體，該聚類分析將試驗樣本分為兩大組，其中長江群體和綏芬河群體最先聚為一支，而合浦群體和日本群體被聚為另外一支。

3 討 論

3.1 綏芬河絨螯蟹與日本絨螯蟹形態特征差異

利用基于地標點的幾何形態測量法量化形態特征差異并用于不同物種或不同地理種群之間的鑒別正受到越來越多的關注。由于絨螯蟹具有堅硬的甲殼和近足類動物的足部，它們可以為形態特征分析提供豐富而準確的數據。如鄭朝臣等[15]通過地標點法區分長江水系不同產地的池塘養殖絨螯蟹，姜曉東等[16]利用地標點法考察幾大水系野生中華絨螯蟹的形態特征差異。本研究中，相對于日本本土與合浦流域的日本絨螯蟹，聚類分析將長江群體和綏芬河群體最先聚為一支，主成分分析中長江群體與綏芬河群體部分重疊并形成較為集中的一塊區域，此外判別分析中長江群體與綏芬河群體之間存在一定的誤判風險，這些結果均清晰地表明，綏芬河流域絨螯蟹與長江水系絨螯蟹形態特征更為接近，因此它們應該均屬于中華絨螯蟹。而王武等[9]研究表明，綏芬河絨螯蟹的形態特征與日本絨螯蟹更為接近，這可能是由于其綏芬河絨螯蟹采集于綏芬河與日本海交匯的俄羅斯符拉迪沃斯托克，而本研究中綏芬河絨螯蟹采集于綏芬河在中國境內的河段，從而造成兩者結果迥異。此外，遼河水系扣蟹常被銷往黑龍江地區供成蟹養殖，綏芬河流域野生個體受到了逃逸至自然水體中遼河水系中華絨螯蟹的基因干擾，其外形特征也逐漸趨同于中華絨螯蟹。

表4 不同地理種群絨螯蟹判別結果

圖5 不同地理種群絨螯蟹聚類Fig.5 Dendrogram of cluster analysis among different geographic populations of wild mitten crab

3.2 綏芬河絨螯蟹與中華絨螯蟹形態特征差異

雖然主成分分析中長江群體和綏芬河群體中部分散點相互重疊，但兩群體大體上相對集中，此外，雖然判別分析中長江群體和綏芬河群體個體之間存在誤判風險，但整體判別準確率較高(87%～93%)，這些結果均說明，長江群體和綏芬河群體絨螯蟹之間仍存在一定的形態特征差異。已有研究表明，不同地理條件下水生動物的形態差異與其棲息環境相適應，底質、水流、溫度和食物等環境因素均能產生如體型和行為等方面的形態差異[17]。本研究中，兩群體中華絨螯蟹所生存的長江與綏芬河環境條件各具特點，兩群體形態特征在生長過程中均產生了適應性變化，加之長期的地理隔離，從而形成明顯的形態特征差異[18]。在之前形態可塑性的研究中，美洲藍蟹(Callinectessapidus)在含有敵害生物的環境中蛻殼數次后側刺長度顯著增加[19]，此外，不同水系野生絨螯蟹移至池塘并人工養殖一代后形態特征趨于一致[20]，均體現出甲殼動物側刺在野外環境中抵御敵害的功能，因此本研究中兩群體間的形態差異還可能與其所屬水域的生物資源特性有關。但表型特征的地理差異也可能是遺傳物質長期進化的結果，因此很難判斷觀察到的這些形態差異哪些直接受到環境的誘導，哪些由基因控制[21]。與頭胸甲上額刺、側刺、疣突和凹槽等形態結構相比，四肢作為絨螯蟹直接接觸自然環境的部位，應當可以更充分地反映環境差異所導致的形態特征差異，但如何突破硬組織的限制而采集絨螯蟹附肢等結構穩定性較差部位的形態信息，仍需進一步嘗試。

3.3 中華絨螯蟹與日本絨螯蟹形態特征差異

中華絨螯蟹與日本絨螯蟹是分布于我國大陸沿海最主要的兩種絨螯蟹，基于傳統形態測量法對主要流域中野生中華絨螯蟹和日本絨螯蟹形態特征進行多變量分析的研究已有充分報道。李晨虹等[22]通過聚類分析將長江、甌江、遼河和黃河水系的中華絨螯蟹聚為一支，將珠江和合浦的日本絨螯蟹聚為另外一支；高天翔等[6]在對10個日本絨螯蟹群體與中華絨螯蟹形態特征的主成分分析中，日本絨螯蟹與中華絨螯蟹被完全分為兩大支；王武等[23]在對歐洲萊茵河、長江和合浦水域絨螯蟹形態特征的聚類分析中，長江和歐洲萊茵河野生中華絨螯蟹先聚為一類，然后再與合浦流域的日本絨螯蟹相聚；王茜等[24]通過聚類分析將海河、甌江、遼河和長江水系的中華絨螯蟹聚為一大支，將合浦和俄羅斯的日本絨螯蟹聚為另外一大支。本研究基于地標點法對長江、黃河、遼河和甌江水系野生中華絨螯蟹的聚類分析結果與之類似，主成分分析中綏芬河群體與長江群體形成較為集中的一塊區域，而日本群體與合浦群體形成另外一塊較為集中的區域，此外，聚類分析中長江群體和綏芬河群體最先聚為一支，而合浦群體和日本群體被聚為另外一支，這些結果均驗證了中華絨螯蟹與日本絨螯蟹之間的形態特征差異。在絨螯蟹屬的種類區分和種群識別中，頭胸甲上額刺、側刺、疣突和凹槽等形態結構均為重要的分類依據[25-26]。本研究形態差異可視化分析中，額刺和側刺的形態特征同樣差異較大，主要表現為長江群體和綏芬河群體絨螯蟹的額刺和側刺長度稍長于日本群體與合浦群體絨螯蟹，而疣突和凹槽位點差異較小，這與之前研究中日本絨螯蟹與不同水系中華絨螯蟹形態特征比較的結果相一致[7]。

4 結 論

綜上，地標點幾何形態測量法的結果表明，相對于日本本土和合浦流域的日本絨螯蟹，綏芬河流域野生絨螯蟹的形態特征更接近于長江水系的中華絨螯蟹，這說明綏芬河絨螯蟹應屬中華絨螯蟹，同時也驗證了中華絨螯蟹與日本絨螯蟹的形態特征差異。綏芬河流域絨螯蟹與我國其他各水系絨螯蟹的親緣關系有待通過分子生物學進行進一步的研究。