脂肪氧合酶催化亞油酸氧化對豬肌原纖維蛋白乳化性能的影響

李穎,李保玲,范鑫,白雪,黃峻榕,曹云剛

(陜西科技大學 食品與生物工程學院,陜西 西安,710021)

法蘭克福香腸和博洛尼亞香腸等乳化類肉制品因質地細膩、汁液豐富、口味獨特等優點深受世界各地消費者的喜愛,在這種乳化性肉制品中,脂肪球或油滴被包裹并嵌入了蛋白質基質中從而形成了不均勻的復合結構[1-3]。盡管有肌漿蛋白和基質蛋白的存在,肌原纖維蛋白(myofibrillar protein,MP)作為肌肉蛋白中含量最高的組分,在包裹脂肪微粒和小油滴的乳液界面蛋白膜的形成及熱誘導蛋白凝膠網絡形成過程中起著重要作用,因而在很大程度上決定了乳化肉制品的質構、風味等性質[4-5]。

乳化類肉制品的脂肪含量可高達20%～30%,在加工和貯存過程中,由于脂肪和蛋白質的共存,脂肪氧化和蛋白氧化很可能是相互關聯的。已有研究表明,脂質過氧化氫、脂質自由基及其衍生的活性醛類物質均可誘導蛋白氧化,且蛋白本身也極易發生氧化反應,進而對蛋白的結構和功能特性造成影響[15-17]。然而關于氧化脂質對MP乳化性能影響的研究非常有限,脂肪酶催化的不飽和脂肪酸氧化可以產生氧化脂質,前期的研究揭示了亞油酸誘導的氧化修飾對豬MP的理化性質和膠凝性能的影響,本研究的目的是評價亞油酸氧化對MP乳化性能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

豬外脊肉(Longissimuslumborum)、金龍魚大豆油,當地超市(陜西西安)購買；大豆脂肪氧合酶、水溶性維生素E(trolox),美國Sigma-Aldrich公司；亞油酸(>95%),上海阿拉丁化學有限公司；其他試劑至少為分析純。

1.2 儀器與設備

HR/T20MM立式高速冷凍離心機,湖南赫西儀器裝備有限公司；高剪切分散乳化機,上海弗魯克(FLUKO)科技發展有限公司；Mastersizer 2000激光粒度分析儀,英國Malvern Instruments有限公司；Haake-Mars 60 流變儀、DXR2顯微共聚焦拉曼光譜儀,德國Thermo Fisher Scientific公司；安東帕LitesizerTM500納米粒度及Zeta電位分析儀,奧地利Anton Paar公司；DM2500M顯微鏡,德國Leica公司。

1.3 MP的提取及樣品制備

1.3.1 MP 的提取及氧化處理

MP的提取參照PARK等[17]的方法進行,使用雙縮脲法以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)作為標準測定蛋白質量濃度,將所得MP置于碎冰浴4 ℃保存并在48 h內使用。用含0.4 mol/L NaCl的25 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.2)將MP稀釋至45 mg/mL,將MP溶液分散于脂肪氧化體系(含0.5～10.0 mmol/L亞油酸,3 750 U/mL脂肪氧合酶)使MP質量濃度達到30 mg/mL并于4 ℃反應12 h。通過添加終濃度為1 mmol/L的trolox來終止氧化反應,未添加氧化體系的MP溶液為空白對照。

1.3.2 MP 乳液的制備

采用25 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含0.4 mol/L NaCl,pH 6.2)將氧化處理后的蛋白溶液分別稀釋至1、10、30 mg/mL。向稀釋后的MP溶液中加入20%(體積分數)純大豆油,混合液使用高剪切分散乳化機在13 000 r/min下乳化2.5 min,從而得到新鮮的MP乳液。除去測定蛋白乳液流變性能(30 mg/mL)以及蛋白乳化活性、乳化穩定性(1 mg/mL)外,其余蛋白乳化性能測定如粒度等均使用質量濃度為10 mg/mL的蛋白。

1.4 乳化活性(emulsifying activity index,EAI)和乳化穩定性(emulsifying stability index,ESI)的測定

根據KEVIN等[18]提出的比濁法并略做改動測定MP乳液的EAI和ESI。按1.3.2乳液的制備方法制得新鮮乳液,立即從距離瓶底0.5 cm處取100 μL乳液置于試管中,而后加入5 mL 1 mg/mL SDS溶液,混勻后使用紫外分光光度計測定其在500 nm處的吸光度,10 min后再次于相同部位取樣重復測定,以1 mg/mL SDS溶液在500 nm處的吸光度作為空白對照。EAI和ESI的計算如公式(1)、公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：A0,A10分別為蛋白乳液在0、10 min時于 500 nm處的吸光值；φ為油相體積分數；ρ為乳化前蛋白質溶液中肌原纖維蛋白質量濃度,g/mL；N為稀釋倍數。

1.5 MP乳液的粒度測定

采用靜態光散射法對蛋白乳液樣品的平均粒徑進行了分析。測量時以蒸餾水作為分散介質,分散劑折射率為1.330,乳液的粒徑分布結果由平均粒徑(d3,2和d4,3)表示,重復測定3次取其平均值。

1.6 MP乳液的Zeta電位測定

制得的新鮮蛋白乳液用25 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含0.4 mol/L NaCl,pH 6.2)按體積比1∶100進行稀釋。取1 mL稀釋后的乳液置于微量樣品池中,平衡時間設定60 s,測試溫度為25 ℃,多次測定取其平均值。

1.7 MP乳液的界面蛋白含量測定

參照CHANYONGVORAKUL等[19]所描述的方法略做修改測定界面吸附蛋白含量。新鮮乳狀液在11 000×g下離心35 min,將乳脂和乳清相分離,使用濾膜過濾乳清相。以BSA作為標準蛋白來計算乳清相蛋白的質量濃度。界面吸附蛋白含量計算如公式(3)所示：

(3)

式中：ρ0和ρ1分別代表初始蛋白乳狀液以及乳清相中的蛋白濃度。

1.8 MP乳液的流變學特性

采用Haake-Mars 60流變儀在25 ℃下對MP乳液的流變特性進行了表征。平行板(直徑35 mm)間距設定為1 mm,在0.1～300 s-1的剪切速率范圍內,測定乳液的穩態剪切流變特性,并對乳液的剪切速率和表觀黏度之間的關系進行表征。通過頻率掃描測定乳液的動態黏彈特性：頻率范圍為0.1～10 Hz,應變為0.5%(處于線性黏彈區間),記錄儲能模量(G′)和損耗模量(G″)。

1.9 MP乳液的微觀結構表征

使用萊卡DM2500M光學顯微鏡觀察MP乳液的微觀結構,取適量新鮮乳液樣品制備玻片標本,在室溫下于40×物鏡下進行觀察。MP乳液樣品的圖像用顯微鏡上附帶的相機進行記錄和分析。

1.10 MP乳液的疏水相互作用和氫鍵作用表征

新鮮的蛋白乳液使用DXR2顯微共聚焦拉曼光譜儀和DXR 785 nm激光光源進行光譜測定。高功率(35 mW)激光通過顯微鏡10×/0.25 BD定向聚焦于MP乳液,光譜的獲取條件設定為：收集曝光時間30 s；孔徑50 μm；光斑直徑為3.1 μm；分辨率4.7～8.7 cm-1。數據由OMNIC軟件收集后使用LabSpec對所得光譜進行平滑、基線校正并使用1 003 cm-1處的苯丙氨酸帶進行歸一化處理,記錄760 cm-1處的歸一化強度和830、850 cm-1的相對強度比。

1.11 數據分析

本研究中所有實驗均重復2～3次,數據使用Statistix 9.0分析軟件通用線性模型進行方差分析,采用LSD全配對多重比較方法進行顯著性分析,差異具有統計學意義(P<0.05)。使用Sigma Plot 12.5軟件進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 氧化MP乳液的EAI和ESI分析

脂肪氧化體系中亞油酸濃度對MP乳液EAI和ESI的影響如圖1所示。與未氧化MP樣品相比,當亞油酸濃度低于1.0 mmol/L時,氧化MP乳液的EAI和ESI值隨亞油酸濃度的增加而增大,而亞油酸濃度的進一步增加(3.0～10.0 mmol/L)則會導致樣品EAI和ESI值的顯著降低(P<0.05)。低濃度氧化亞油酸誘導MP構象發生變化,蛋白質結構部分解折疊從而暴露出更多的疏水基團,因此MP在形成乳液過程中能更好地吸附在水油界面上,從而有效提升了MP乳液的EAI和ESI[20]。過度氧化情況下蛋白共價交聯形成不溶性的蛋白聚集體,蛋白分子柔韌性降低、蛋白分子間的靜電相互作用以及乳狀液界面—水相互作用減弱,乳液體系難以形成穩定的界面膜,蛋白與脂肪間的交聯能力降低,導致乳狀液分層加快,乳化活性和乳化穩定性不斷降低[21]。在羥自由基氧化體系中,李艷青等[21]研究發現隨著H2O2濃度的增加,鯉魚MP的EAI和ESI不斷降低；在脂肪氧化體系中,王丹丹等[22]研究發現,適量添加氧化亞油酸(<4.5 mmol/L)時,核桃分離蛋白樣品的EAI和ESI有明顯改善,而過量添加時EAI值顯著下降、ESI變化則不明顯。猜測實驗結果的不一致性與氧化劑種類以及蛋白種類的差異等因素有關。

圖1 亞油酸添加量對MP乳液EAI及ESI的影響

2.2 氧化MP乳液的粒度分析

MP乳液的粒徑變化如圖2所示,乳液的平均粒徑通常用來反映蛋白質的乳化能力,包括液滴的形成與穩定過程。相關研究表明乳液的EAI、ESI與乳液的平均粒徑d3,2和d4,3有關：一定程度上乳液平均粒徑越小,樣品乳化性能越好[23]。未氧化MP樣品的d3,2和d4,3值分別為29.14和48.32 μm,亞油酸濃度為1.0 mmol/L時,乳液的d3,2和d4,3分別下降為27.01和45.86 μm,而后隨著亞油酸濃度從1.0 mmol/L增加到3.0 mmol/L,MP乳液的平均粒徑(d3,2和d4,3)顯著增大(P<0.05),這也與MP樣品EAI和ESI的實驗結果基本一致。類似研究表明輕度氧化降低了乳液的平均粒徑(d3,2和d4,3),而嚴重氧化增大了過氧化氫自由基生成體系的平均粒徑[24]。有趣的是本實驗中亞油酸濃度為10.0 mmol/L時,氧化MP乳液的平均粒徑反而低于亞油酸濃度為3.0 mmol/L時的MP樣品,葉鳳凌等[25]在研究2,2′-鹽酸脒基丙烷(2,2′-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride,AAPH)熱解產生的烷過氧自由基濃度對兔肉MP粒徑影響時得到類似結果,可能是AAPH濃度過高(10.0 mmol/L)導致MP被過度氧化、肽鍵斷裂從而降低了MP樣品的粒徑。

圖2 亞油酸添加量對MP乳液平均粒徑的影響

2.3 氧化MP乳液的Zeta電位分析

乳液的Zeta電位是反映乳液體系潛在穩定性的重要指標,相關研究表明乳液的絮凝、沉淀主要與界面層上的靜電作用力有關,乳液液滴間的靜電作用力越強則乳液體系的穩定性越好[26]。Zeta電位的變化主要由氧化誘導的氨基酸側鏈的修飾和蛋白質結構的變化引起[24]。如圖3所示,所有MP乳液樣品的Zeta電位均為負值,推測是因為MP乳液的pH值(pH 6.2)高于其等電點(pH 5.3)。與MP乳液EAI、ESI結果相似,當亞油酸濃度低于1.0 mmol/L時,隨著亞油酸濃度的增加,Zeta電位的絕對值顯著增大(P<0.05),當亞油酸濃度繼續增加時(3.0～10.0 mmol/L),Zeta電位的絕對值呈現下降趨勢。與未氧化MP乳液相比,亞油酸濃度為10.0 mmol/L時,Zeta電位絕對值下降了27.8%。這一結果表明在輕度氧化條件下,蛋白結構適度展開暴露出更多電荷的結合位點,從而增強了乳液間的靜電排斥力,起到穩定乳液、減少液滴聚集的作用[27-28],而過度氧化則相反。

圖3 亞油酸添加量對MP乳液Zeta電位的影響

2.4 氧化MP乳液的界面吸附蛋白含量

乳液的界面吸附蛋白含量可以作為評價乳液穩定性的一個重要指標。如圖4所示,與未氧化MP樣品相比,界面吸附蛋白含量隨著亞油酸濃度的增加呈現先增大后減小的變化趨勢,并在亞油酸濃度為1.0 mmol/L時達到最大值,這一結果與ZHOU等[29]的研究結果相似。輕度氧化導致蛋白質結構部分展開,促進蛋白質疏水基團的暴露、蛋白柔性增加,同時由于蛋白質分子間相互作用力的改變,使得更多的蛋白質吸附在乳狀液表面,引起乳液的平均粒徑減小(圖2)、蛋白質間的靜電斥力增強(圖3)。而過度氧化情況下,蛋白與蛋白之間形成過量的強共價鍵,使得蛋白難以附著到乳液界面或易于從乳液界面脫離,界面蛋白吸附量減少、乳液穩定性降低[30]。

圖4 亞油酸添加量對MP乳液界面蛋白吸附含量的影響

2.5 氧化MP乳液的流變學特性

乳液的流變學性能也與乳液體系穩定性息息相關,乳液的表觀黏度隨剪切速率的變化關系如圖5-a所示,所有的乳液均表現出明顯的剪切稀化的非牛頓流體特性,乳狀液的表觀黏度隨著剪切速率從0～300 s-1的增加而逐步減小。結合相關文獻可知這一結果主要是由脂肪球的絮凝作用引起[31]。值得注意的是,在任何剪切速率下未被氧化MP乳液均表現出較低的表觀黏度,而氧化MP乳液的表觀黏度隨亞油酸濃度的增加而增加(0.5～1.0 mmol/L),隨著亞油酸濃度的進一步增加(1.0～10.0 mmol/L)而降低。較大的乳狀液表觀黏度可以減緩乳化液液滴的遷移和碰撞,減少液滴聚集,從而提高乳液體系穩定性,這一結果與上述乳液的乳化穩定性和Zeta電位的結果是一致的(圖1、圖3)。

圖5 亞油酸添加量對MP乳液流變性能的影響

MP乳液的G′和G″隨頻率的變化曲線如圖5-b所示,在測試的線性黏彈范圍內,所有樣品乳液的G′值都高于G″值,說明其內部存在弱凝膠狀結構,從而保證了乳液的穩定性[32]。隨著振蕩頻率的增加,不同乳液的G′和G″都在逐漸增加,這一點在其他凝膠狀乳液中已有報道[31,33]。其中G′值的增加最有可能是由液滴與蛋白質間的相互作用引起[34]。亞油酸濃度為1.0 mmol/L乳液的G′和G″值在所有乳液中最高,說明輕度氧化增強了脂肪和蛋白質之間的一些非共價相互作用,從而增強了乳液的彈性性能和穩定性。

2.6 MP乳液的微觀結構

如圖6所示,未氧化MP和不同氧化程度MP樣品制備的乳狀液微觀結構存在明顯差異。結合圖2乳狀液的粒徑變化發現,與未氧化MP乳液相比,隨著亞油酸濃度的增加(0.5～10.0 mmol/L),乳狀液顆粒呈現先減小后增大的變化趨勢(圖6-a～圖6-e),亞油酸濃度為1.0 mmol/L時,MP乳液的微觀結構發生顯著變化：乳化液的顆粒明顯變小,同時分布也更加的均勻,結合以上EAI、ESI、粒徑、Zeta電位等乳化性質的結果,可以認為蛋白質氧化程度影響了乳液中蛋白質和脂滴的吸附和分布。王丹丹等[22]研究發現蛋白質氧化會影響蛋白的表面疏水性及其微觀結構,從而導致蛋白表面活性、蛋白質分子的柔韌性和電荷的變化,而上述變化最終影響了蛋白質的乳化性能。

a-對照;b-0.5 mmol/L亞油酸;c-1.0 mmol/L亞油酸;d-3.0 mmol/L亞油酸;e-10.0 mmol/L亞油酸

2.7 MP乳液的疏水相互作用及氫鍵作用

乳液的色氨酸殘基(I760/I1003)和酪氨酸雙重態(I850/I830)的拉曼強度如表1所示,MP乳液接近760 cm-1處的歸一化強度提供了關于蛋白質乳液疏水相互作用的信息[35]。結果表明,與未氧化MP樣品相比,亞油酸濃度增加到1.0 mmol/L時,樣品的歸一化強度(I760/I1003)顯著增加(P<0.05),而隨亞油酸濃度的進一步增加(3.0～10.0 mmol/L),I760/I1003值未見明顯變化(P>0.05)。先前研究表明,拉曼條帶歸一化強度(I760/I1003)的增加意味著埋藏的色氨酸殘基暴露在極性溶液中,從而增強了乳液的疏水相互作用[36]。

表1 亞油酸添加量對MP乳液的疏水相互作用及氫鍵作用的影響

酪氨酸雙重態的比值(I850/I830)可以監測MP乳液的酪氨酸殘基微環境的變化[37]。結果表明,與未氧化MP樣品相比,隨著亞油酸濃度從0.5 mmol/L增加到1.0 mmol/L,酪氨酸雙重態比值(I850/I830)無明顯變化(P>0.05),而當亞油酸濃度由1.0 mmol/L增大到10.0 mmol/L時,酪氨酸雙重態比值顯著降低(P<0.05)。酪氨酸雙重態比值(I850/I830)為1.29～1.41,說明酪氨酸殘基(—OH)主要暴露在水環境中與水形成中、弱氫鍵。色氨酸殘基(I760/I1003)和酪氨酸雙重態比值(I850/I830)的結果表明,輕度氧化增強了MP乳液的疏水相互作用和氫鍵作用,這可能是輕度氧化條件下乳液體系黏彈性及穩定性提高的內在原因。

3 結論

不同氧化程度對豬肌原纖維蛋白乳化性能的影響具有顯著差異。適度氧化導致乳液平均粒徑下降(d3,2和d4,3)、Zeta電位絕對值增加、表觀黏度增強、G′和G″以及AP%增加,在一定程度上提高了MP的EAI和ESI；但過度氧化則會嚴重破壞MP的乳化性能。因此,在肉制品加工和原料肉貯存過程中要合理控制氧化程度,以提高原料肉的加工性能、改善肉制品的品質。