甘藍型油菜隱性核三系臨保系遺傳多樣性分析

陳 雪，王 瑞，張勝森，郭青青，李加納

西南大學 農學與生物科技學院，重慶 400715

甘藍型油菜是我國重要的油菜作物[1]，存在明顯的雜種優勢.雜種優勢利用的途徑包括化學殺雄[2]、波里馬不育[3]、蘿卜質不育[4]、顯性核不育[5]、自交不親和性[6]、細胞質+細胞核雙重不育[7-8]和隱性核不育[9-10]等，隱性核不育因其恢復源廣泛且配組自由成為雜種優勢利用的主要途徑.但隱性核不育存在需與臨保系搭配使用這一問題，讓其利用受到很大限制.

遺傳多樣性分析是種質資源評價和雜種優勢利用的基礎.隨著高通量測序技術和功能基因組學的發展，SNP芯片為作物種質資源的遺傳多樣性分析提供了新的技術手段，目前已有甘藍型油菜SNP芯片應用于聚類分析和基因定位研究[11-12].本文以西南大學油菜生物學團隊選育出的39份甘藍型油菜隱性核三系臨保系為材料，通過武漢雙綠源創芯科技研究院有限公司提供的油菜50K SNP芯片分析評價其遺傳多樣性，為臨保系配制隱性核不育提供準確的遺傳背景指導.

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料39份，為西南大學油菜生物學選育的甘藍型油菜隱性核三系臨保系.

1.2 方 法

1.2.1 播種與取樣

2018年10月初將材料播種于重慶市北碚區西南大學歇馬油菜基地試驗田，于苗期摘取每份臨保系材料生長大小一致的3個單株的幼嫩葉置于2 mL離心管中，-20 ℃冰箱保存.

1.2.2 DNA提取

用CTAB法[13]提取DNA，用1.0%瓊脂糖電泳檢查DNA的質量，用Nanodrop核酸蛋白質分析儀檢測DNA的濃度，并將DNA濃度稀釋成50 ng/L，-20 ℃保存備用.

1.2.3 SNP芯片分析

使用油菜50K高通量芯片對39份臨保系的每份材料進行DNA光學掃描，通過光學設備掃描“紅”或“綠”和“有”或“無”來區分一個SNP位點.此SNP芯片檢測通量大，幾十個位點可以通過1次檢測完成，并且具有高達99.9%以上的檢測準確性.

1.2.4 數據統計與分析

在R3.5.0環境下使用CMplot包(https：//github.com/YinLiLin/R-CMplot)對臨保系所有SNP位點統計各染色體SNP密度；基于neighbor-joining算法使用MEGA5[14]軟件對39個臨保系SNP標記數據進行聚類分析；Lee等[15]在2014年開發出SNPhylo流程(http：//chibba.pgml.uga.edu/snphylo/)，BASH命令行一步執行生成遺傳進化樹.39個臨保系SNP標記數據文件通過選擇參數提取具有代表性的SNP位點，MUSCLE多重比較，DANML制作最大似然樹得到進化樹圖像.

2 結果與分析

2.1 表型觀察與統計

39份甘藍型油菜臨保系在品質、角果長度、種子顏色、花瓣顏色、抗倒、株型和生育期等方面不盡一致，其簡易表型觀察如表1.RW01-RW21品質為低芥酸低硫苷，花瓣顏色為典型黃色.RW22-RW39材料中，RW22為低芥酸高硫苷，RW37為高芥酸高硫苷，其余品質都為高芥酸低硫苷，而花瓣色澤為白花、粉白色、粉桃色、桃紅色不等.這些臨保系的隱性上位基因和隱性不育基因處于隱性純合狀態，其他遺傳背景通過各種育種手段和技術發生了重組和交換.

表1 39份甘藍型油菜隱性核三系臨保系簡易表型觀察

2.2 SNP密度分布

利用武漢雙綠源創芯科技研究院有限公司的油菜50K SNP芯片對39份臨保系材料進行基因型鑒定，共鑒定出25 401個高質量的SNP標記，使用CMplot R包繪制19條染色體SNP密度分布圖(圖1).結果顯示，SNP標記并非在染色體上均勻分布，染色體Chr11和Chr14出現SNP標記數大于113個/Mb，而幾乎每條染色體都存在SNP標記空缺的現象.

圖1 SNP密度分布圖

2.3 MEGA5分析39份臨保系遺傳多樣性

利用生物學軟件MEGA5和SNP標記數據文件，基于neighbor-joining算法對39份臨保系進行聚類分析(圖2).在0.3閾值下，39份材料可聚成A，B，C，D 4個大類，A類群只包括RW22，為黑籽粉花臨保系；B類群體包括19份材料，除RW03，RW13兩個角果極短的黃籽黃花材料外，其余為高芥酸、非黃花臨保系；C類群體包括10份材料，為低芥酸低硫苷、黃籽黃花臨保系；D類群體包括9份材料，為低芥酸、抗倒伏黃花臨保系.因此，聚類分析可用于區別花色和品質性狀，也可應用于甘藍型油菜臨保系遺傳背景和性狀之間的比較和評價.

圖2 39份甘藍型油菜臨保系聚類圖

2.4 SNPhylo分析39份臨保系遺傳多樣性

利用生物學軟件SNPhylo分析SNP位點數據，構建39份臨保系材料的遺傳進化樹(圖3).進化樹顯示出5個主干分支，RW03，RW13和RW22分布在中心節點附近.低芥酸低硫苷和黃花臨保系分布在兩個主干分支上，一個分支上有RW01，RW15，RW20，RW14，RW18，RW19，RW17等，另一個主干分支上有RW02，RW07，RW10，RW06等.同一主干分支的臨保系遺傳背景最為接近，其分布距離反映出臨保系之間的遺傳距離.而高芥酸非黃花臨保系分布在另外2個分支上.RW28，RW23，RW35，RW26，RW27，R38，RW25在同一分支上分散.RW31，RW24，RW30和RW32，RW37以及RW34，RW39，RW36分別處于同一個主干分支下的3個次生分支上.此外，還有一主干分支上分布著RW29和RW33.遺傳進化樹可區分品質性狀和花瓣顏色性狀，但對種子顏色、抗倒等其他性狀不能區分.與聚類分析結果一致，但遺傳進化樹與聚類圖相比較更為形象直觀，材料的遺傳親緣關系反映尤為充分.

圖3 39個甘藍型油菜臨保系遺傳進化樹

3 討論和結論

利用SSR，AFLP，SNP，SCAR等各種標記方法，甘藍型油菜遺傳多樣性分析已在黃籽油菜[16]、隱性核不育[17]、雜交親本評價、油菜區試指紋圖譜[18]等方面做了很多研究工作.甘藍型油菜隱性核三系臨保系在選育策略[19-20]、分子標記[21-22]、專利和應用[23]等方面也取得了多項成果，但利用SNP芯片分析甘藍型油菜隱性核三系臨保系遺傳多樣性還未有文獻報道.本研究利用50K油菜芯片SNP對39份甘藍型油菜臨保系材料進行遺傳分析，結果表明臨保系材料間具有較好的遺傳多樣性.根據SNP數據繪制染色體SNP密度分布圖，SNP標記基本覆蓋了整個染色體組，但并非均勻分布，甚至每條染色體都出現SNP標記空缺現象，表明武漢雙綠源創芯科技研究院有限公司開發的油菜50K SNP芯片設計不夠完善，也說明臨保系材料數量太少，遺傳變異類型不夠豐富.

對39份臨保系材料的聚類結果表明，表型為粉白色、抗倒伏、株型性狀優異的臨保系材料RW32和RW37優先聚集到一起；表型為粉桃色、葉片大、花期晚的臨保系材料RW34，RW36也優先聚集到一起，這充分說明SNP芯片揭示的遺傳多樣性和性狀基本一致，可以充分反映材料之間的遺傳差異.在該研究中，臨保系RW22單獨聚為一類，與其他材料具有明顯的遺傳特異性，而在表型上該材料確實具有黑籽、粉花等非常特殊的農藝性狀，需要對該特異種質資源加以保存和利用.由此可見，SNP聚類結果能較好地反映材料間的親緣關系，可為種質資源的利用提供參考.