IFN-α/STAT1/STAT3信號在急性期川崎病PB/Breg細胞分化失衡機制中的作用及意義

俞靈盈，王國兵，，溫鵬強，梅潔花，齊中香，徐明國，劉琮，李成榮

1.遵義醫科大學珠海校區，廣東 珠海 519041；

2.深圳市兒童醫院兒科研究所，廣東 深圳 518038；

3.深圳市兒童醫院心血管內科，廣東 深圳 518038

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一種常見的嬰幼兒急性全身性中、小血管炎綜合征，可導致嚴重的冠狀動脈損傷或冠狀動脈瘤，其病因及發病機制迄今仍不完全清楚。大量的臨床研究及流行病學調查表明KD可能是感染引起的急性自身免疫性血管炎綜合征，但導致自身免疫耐受異常的原因尚不清楚[1-4]。除過度的系統性炎癥外，KD患兒還存在B細胞異常活化、自身抗體反應、漿細胞多器官浸潤、外周血免疫復合物異常增高等臨床表現，提示體液免疫異常可能在KD的免疫發病機制中發揮著重要作用[1，5-7]。α-干擾素(interferonα，IFN-α)通過下游信號傳導及轉錄活化因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)、信號傳導及轉錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 1，STAT3)信號誘導未成熟B細胞分化為漿母細胞(plasmablast，PB)和調節性B細胞(regulatory B cell，Breg)，前者最終轉化為漿細胞并介導抗體生成及體液免疫反應，后者負反饋抑制IFN-α信號及PB細胞分化，從而維持機體免疫動態平衡[8-12]。本文觀察IFN-α/STAT1/STAT3信號改變對KD患兒PB/Breg細胞分化失衡的影響，旨在進一步探討KD的免疫發病機制，為KD的臨床診療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年3月至2020年10月深圳市兒童醫院診治的KD患兒38例，其中男性23例，女性15例；年齡1.2～5.1歲，中位年齡2.68(2.17，3.59)歲；病程均在10 d以內。診斷按日本川崎病研究會制定的標準：(1)持續發熱(39℃～40℃)≥5 d；(2)手指或足指趾端硬性腫脹，第2～4周手腳掌、指趾尖或肛周可出現膜狀脫屑；(3)全身多形性充血皮疹，無水泡及結痂；(4)雙側眼結膜彌漫性充血，一般無分泌物；(5)口唇或口腔黏膜變化，如草莓舌、口咽黏膜充血，嘴唇紅腫、皸裂或流血；(6)頸部淋巴結非化膿性腫大，單側或雙側，直徑≥1.5 cm。(1)+(2)～(6)項中符合≥4項，且能排除其他可以造成類似癥狀的疾病，可確診為川崎病。所有KD患兒均行動態心臟彩色多普勒檢查，其中KD合并冠狀動脈損傷的診斷指標為：(1)冠狀動脈擴張：＜3歲冠狀動脈內徑＞2.5 mm，3～5歲冠狀動脈內徑＞3.0 mm，≥5歲冠狀動脈內徑＞4.0 mm；(2)冠狀動脈瘤：①冠狀動脈內徑4.0～8.0 mm；＞5歲冠狀動脈擴張的內徑為正常的1.5～4倍；②巨大冠狀動脈瘤：冠狀動脈內徑＞8.0 mm；＞5歲冠狀動脈擴張的內徑＞正常4倍。根據是否合并冠狀動脈損傷將KD患兒分為冠狀動脈損傷組(CAL組，16例)和無冠狀動脈損傷組(NCAL組，22例)。所有患兒分別于急性期(KD組)及IVIG治療有效后4～5 d(KDIVIG組)取血備檢。同期健康兒童28例為對照組(Ctrl組)，其中男性16例，女性12例；年齡1.5～5.6歲，中位年齡2.64(1.99，3.83)歲。Ctrl組、KD組和KDIVIG組、CAL組和NCAL組患兒年齡和性別比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。所有血樣均立即送檢。受試者家屬對實驗均已知情并簽署知情同意書，經醫院倫理委員會審核并獲得批準(JCYJ20180228175700233)。

1.2 外周血PB、Breg細胞比例及相關信號蛋白檢測 采用流式細胞術檢測：①經CD19-APC-Cy7、CD24-eFluor450、CD38-PerCP-Cy5.5、CD40-PE表面染色，破除紅細胞后，洗滌并上機檢測外周血CD19+CD24+CD38hi(Breg)、CD19+CD24-CD38hi(PB)細胞比例及CD19+B細胞表面細胞分化抗原(CD40)蛋白表達水平；②經CD19-APC-Cy7表面染色，破除紅細胞后，固定、破膜，加入磷酸化的STAT1(pSTAT1)-PE、磷酸化的STAT3(pSTAT3)-Alexa Fluor647抗體孵育30 min，洗滌并上機檢測外周血B細胞pSTAT1、pSTAT3蛋白表達水平；③取1 mL抗凝外周血，經密度梯度離心法分離PBMC，按1×106/mL重懸于含1μg/mL Ionomycin、300 ng/mL PMA、2μmol/L Monensin和10%胎牛血清的RPMI1640培養基，于5%CO2、37℃下刺激培養6 h，收獲細胞。經CD19-APC-Cy7、CD24-eFluor450、CD38-PerCP-Cy5.5表面染色后，固定、破膜，加入白細胞介素6(IL-6)-PE-Cy7、白細胞介素10(IL-10)-PE、腫瘤壞死因子α(TNF-α)-APC抗體孵育30 min，洗滌并上機檢測Breg細胞IL-10及B細胞IL-6、TNF-α蛋白表達水平。所有流式結果采用FlowJo Ver 10.6軟件進行數據分析，其中蛋白表達水平采用平均熒光強度(MFI)表示。

1.3 PB、Breg細胞分化相關分子mRNA水平檢測 采用實時熒光定量PCR法：①取500μL抗凝外周靜脈血，與免疫磁珠(美國Life公司，113.31D)混勻孵育并分離CD19+B細胞，經裂解、過柱、洗脫后純化總RNA；②根據逆轉錄PCR試劑盒(美國Life公司，K1632)步驟，以總RNA為模板，合成cDNA；③根據B淋巴細胞誘導成熟蛋白1(Blimp-1)、干擾素調節因子4(IRF-4)、α/β-干擾素受體亞基1(IFNAR1)、α/β-干擾素受體亞基2(IFNAR2)、腫瘤壞死因子受體相關因子3(TRAF3)、細胞因子信號轉導抑制因子1(SOCS1)、細胞因子信號轉導抑制因子3(SOCS3)及β-肌動蛋白(β-actin)mRNA序列，經Oligo 7.0軟件設計、合成引物(表1)；采用實時熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物，RR82LR)進行相對定量分析，結果以待測基因mRNA拷貝數與β-actin mRNA拷貝數的比值表示。

1.4 血漿IFN-α蛋白水平檢測 采用酶聯免疫吸附法(ELISA)：①取部分抗凝外周血，室溫下靜置30 min后，500×g離心15 min，分離上層血漿；②參照ELISA試劑盒(美國Thermal Fisher，BMS216)步驟說明，經酶標儀(美國Thermal Fisher，Synergy H1)檢測標準品和待測樣品孔吸光度；③采用Gen5軟件擬合標準曲線及回歸公式后，計算待測樣品IFN-α蛋白濃度。

1.5 統計學方法 應用SPSS23.0軟件進行數據分析，計量資料呈非正態分布，以中位數(四分位數間距)[M(P25，P75)]表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗后，再進行組間多重比較。KD組SOCS1與pSTAT1、SOCS3與pSTAT3表達的關系予以Pearson相關性分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PB/Breg細胞亞群及轉錄因子、功能相關因子檢測結果 與Ctrl組相比，KD組PB細胞亞群比例及轉錄因子Blimp-1、IRF-4表達顯著升高，Breg細胞亞群比例及IL-10表達明顯降低，其中CAL亞組前三項指標高于NCAL亞組，后二項指標低于NCAL亞組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；經IVIG治療后，KDIVIG組PB細胞亞群比例及轉錄因子Blimp-1、IRF-4表達明顯低于KD組，Breg細胞比例及IL-10表達高于KD組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.2 PB/Breg細胞亞分化調節信號相關分子檢測結果 急性期KD組血漿IFN-α蛋白濃度、CD19+B細胞表面受體CD40、IFNAR1、IFNAR2及下游信號相關分子pSTAT1、IL-6、TNF-α、TRAF3表達水平明顯高于Ctrl組，pSTAT3表達水平低于Ctrl組，其中CAL亞組前八項指標高于NCAL亞組、pSTAT3表達水平低于NCAL亞組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。經IVIG治療后，KDIVIG組血漿IFN-α蛋白濃度及CD19+B細胞CD40、IFNAR1、IFNAR2、pSTAT1、IL-6、TNF-α、TRAF3表達水平低于KD組，pSTAT3表達水平高于KD組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 KD患兒PB、Breg細胞分化調節信號相關分子檢測結果比較[M(P25，P75)]

2.3 IFN-α信號負性調節因子SOCS1/SOCS3表達檢測結果 與Ctrl組相比，KD組外周血B細胞SOCS1、SOCS3表達水平顯著增高，其中CAL亞組SOCS3表達高于NCAL亞組、SOCS1表達低于NCAL亞組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。經IVIG治療后，KDIVIG組SOCS1、SOCS3表達水平明顯低于KD組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

2.4 SOCS與STAT表達的相關性 Pearson相關分析結果顯示，KD組SOCS1與pSTAT1、SOCS3與pSTAT3表達均呈負相關(r=0.67、0.52，P＜0.05)。

注：與Ctrl組比較，a P＜0.05；與NCAL亞組比較，b P＜0.05；與KD組比較，c P＜0.05。

注：與Ctrl組比較，a P＜0.05；與NCAL亞組比較，b P＜0.05；與KD組比較，c P＜0.05。

3 討論

KD的病因及發病機制尚不完全清楚，其發生及病理損傷可能與感染引發的自身免疫功能過度活化有關，但導致自身免疫耐受異常的機制尚未完全闡明[1-4]。除系統性炎癥反應外，KD患兒還存在B細胞多克隆活化、IgA+漿細胞異常增多且呈全身多器官浸潤、外周血免疫復合物及抗自身抗體水平異常增高等現象[1，5-7]，提示KD的發病機制可能與B細胞介導的體液免疫有關，但導致B細胞異常活化的分子機制及介導途徑目前仍不清楚。PB細胞和Breg細胞是一對具有免疫活性作用的B細胞亞群，前者在內、外環境的刺激下最終分化為漿細胞并通過產生抗體而介導體液免疫，后者分泌抑制性細胞因子IL-10而調節機體的免疫反應，從而維持體內免疫反應動態平衡[10-12]。本研究注意到KD組PB細胞亞群比例及轉錄因子Blimp-1、IRF-4表達明顯高于健康對照組，Breg細胞亞群比例及IL-10表達低于健康對照組，其中CAL亞組前三項指標高于NCAL亞組、后兩項指標低于NCAL亞組，經IVIG治療后明顯恢復，差異均有統計學意義。這一結果與國外的報道相一致[13-14]，提示KD患兒免疫發病機制可能與PB細胞過度活化、Breg細胞數量及功能低下有關。但導致急性期KD患兒PB/Breg細胞失衡的調節機制目前仍不清楚。

未成熟B細胞經細胞因子誘導可分化為PB細胞和Breg細胞，因細胞因子濃度不同兩者間可相互轉化，其中IFN-α/STAT1/STAT3信號在這一過程中發揮著關鍵的調節作用[8-10，15]。在共刺激分子CD40被激活的條件下，IFN-α與未成熟B細胞表面受體IFNAR結合，進而激活酪氨酸激酶JAK1(janus kinase 1，JAK1)/STAT1/STAT3信號。活化的JAK磷酸化STAT1和STAT3，其中磷酸化的pSTAT1啟動炎癥因子IL-6、TNF-α的表達并促使未成熟B細胞分化為PB細胞，而pSTAT3誘導抑制性的細胞因子IL-10及Breg細胞產生，維持機體免疫系統的動態平衡[8-9]。為探討IFN-α/STAT1/STAT3信號對PB/Breg細胞失衡的影響，本研究發現KD組血漿IFN-α蛋白濃度、B細胞表面受體CD40、IFNAR1、IFNAR2及下游信號分子pSTAT1、IL-6、TNF-α、TRAF3表達水平明顯高于健康對照組，pSTAT3表達水平低于健康對照組，其中CAL亞組前述8項指標高于NCAL亞組、后一項指標低于NCAL亞組，經IVIG治療后呈不同程度恢復，差異均有統計學意義，提示IFN-α下游信號分子pSTAT1、pSTAT3表達異常可能是導致急性期KD患兒PB/Breg細胞失衡的重要原因。上述結果與MENON等[9]在系統性紅班狼瘡患者中的研究發現較為類似，但目前尚未見有川崎病相關的研究報道。

活化的STAT可啟動負性調節分子SOCS的表達，其中SOCS1抑制STAT1、STAT3的活化，而SOCS3則特異性抑制STAT3的活化，進而形成負反饋抑制效應維持機體免疫動態平衡[16-18]。但目前國內外尚未見有關于KD患兒B細胞SOCS和STAT之間相互調節的研究或報道。為進一步探討導致pSTAT1、pSTAT3表達異常的分子機制，本研究發現KD組外周血B細胞SOCS1、SOCS3表達水平明顯高于健康對照組，其中CAL亞組SOCS1表達低于NCAL亞組、SOCS3表達高于NCAL亞組，而IVIG治療后的KDIVIG組SOCS1、SOCS3表達水平明顯低于KD組，差異均有統計學意義。同時，Pearson相關分析顯示KD組SOCS1與pSTAT1、SOCS3與pSTAT3表達之間均呈負相關，提示急性期KD患兒pSTAT1、pSTAT3表達異常可能與負性調節因子SOCS1表達相對不足及SOCS3過度活化有關。

綜合上述結果，推測感染觸發細胞因子級聯反應，導致急性期KD患兒炎癥細胞因子(如IFN-α等)大量產生。IFN-α與未成熟B細胞表面受體結合并激活下游JAK/STAT信號，其中負性調節因子SOCS1表達相對不足導致pSTAT1過度活化，誘導炎癥因子的產生并促使未成熟B細胞分化成PB細胞，而SOCS3過表達則通過抑制pSTAT3阻礙了Breg細胞的分化，最終導致PB/Breg細胞失衡并推動機體炎癥及體液免疫反應的發展。但這一結論尚需后續大樣本的臨床觀察及動物實驗加以證實。此外，PB/Breg細胞的分化受細胞因子信號、表觀遺傳學等多種機制調控，是否存在其他因素參與調節KD患兒PB/Breg細胞動態平衡仍有待進一步研究。