凍融和新鮮PESA精子行ICSI治療梗阻性無精子癥臨床結(jié)局比較

張海波，李娟，黃勇，符芳翔，吳海芳

海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院生殖科1、產(chǎn)科2，海南 海口 570311

當今社會男性不育群體越來越多，其中無精子癥占男性不育因素的15%～20%，在無精子癥中梗阻性無精子癥占40%[1-2]。但隨著人類輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，經(jīng)皮附睪穿刺取精(percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA)、附睪精子冷凍技術(shù)、卵細胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intra cytoplasmic sperm injection，ICSI)給梗阻性無精子癥(obstructive azoospermia，OA)患者獲得親血緣關(guān)系后代的機會。

OA患者在性激素正常及排除染色體性疾病的情況下進行附睪或睪丸組織的診斷性穿刺檢查是否有精子，但多次穿刺睪丸或附睪可能存在不可逆的損傷，如患者想通過輔助生殖技術(shù)獲得后代，需用經(jīng)睪丸或附睪穿刺取得的新鮮精子行ICSI治療，但精子的獲能與成熟均在附睪中，OA患者穿刺部位首選附睪，如無精子再考慮穿刺睪丸部位[3]。本科一直使用PESA精子行ICSI治療，為了避免再次穿刺給患者帶來身體和心理的傷害及減輕患者的經(jīng)濟負擔，男科醫(yī)生對附睪進行診斷性穿刺檢查獲得活動精子時，實驗室人員采用附睪精子冷凍技術(shù)對診斷性穿刺獲得精子進行冷凍保存，以便后續(xù)用于ICSI治療。但附睪精子經(jīng)過凍融后是否會有損傷，冷凍和新鮮的附睪精子治療OA患者取得的臨床結(jié)局差異如何有待進一步研究，該問題一直存在爭議。本研究旨在探討凍融PESA精子行ICSI治療對助孕結(jié)局的影響，以期更好的指導臨床工作，為患者提供更好的服務(wù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院生殖科2013年4月至2019年11月經(jīng)PESA取精行ICSI治療的161周期OA患者的臨床資料。根據(jù)是否凍融分為凍融PESA精子組(A組，55周期)和新鮮PESA精子組(B組，106周期)。無精子癥的診斷標準參照《2013中華醫(yī)學會男性不育癥診療指南》中的標準，即3次或3次以上精液離心后鏡檢未發(fā)現(xiàn)精子，同時排除不射精或逆行射精。

1.2 方法

1.2.1 附睪穿刺取精 患者取仰臥位，常規(guī)消毒后鋪巾，用0.9%氯化鈉注射液將2%利多卡因注射液稀釋成1%，并在同側(cè)精索局部麻醉下以拇指和食指固定附睪部位，將連接于5 mL注射器的頭皮針穿刺附睪頭部，在注射器保持適當?shù)呢搲籂顟B(tài)下抽吸，直到有足夠量的乳白色或淡黃色的附睪液抽出，并置于含1 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，如果沒有液體抽出可改變穿刺方向抽吸，將抽吸出來的液體注入35 mL的小培養(yǎng)皿中，實驗室人員在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)有足量的活動精子，則終止手術(shù)。鏡檢未找到可用精子，則相同方法穿刺對側(cè)附睪。

1.2.2 附睪精子的冷凍保存和復蘇 (1)冷凍保存：將含有活動精子的附睪懸液用微量梯度離心法離心，棄上清液留取沉淀物，加入2 mL 5%HTF溶液進行洗滌，洗滌后棄上清留取0.3 mL精子懸液加入精子冷凍管，在冷凍管中緩慢加入0.3 mL精子冷凍保護劑充分混勻。將精子凍存管在室溫下靜置3 min，液氮蒸汽內(nèi)懸吊20 min后放入液氮罐中冷凍保存。(2)復蘇：從液氮罐中取出樣本，在室溫下10 min，完全融解后置于37℃培養(yǎng)箱40 min復溫，把復溫后的精液加入到2 mL培養(yǎng)液中洗滌，洗滌后留取0.3 mL精子懸液，在顯微鏡下觀察精子懸液是否有足量精子滿足ICSI需求。若足量則直接用做ICSI，不足量則需重新穿刺取精。

1.2.3 促排及采集卵母細胞行ICSI技術(shù) 按本科常規(guī)超促排方案進行，然后監(jiān)測卵泡發(fā)育和血清激素情況，當平均直徑≥18 mm的卵泡有1～2個時，或當平均直徑≥17 mm的卵泡有3個及以上時，給予人絨毛膜促性腺激素(HCG)4 000～10 000 IU或艾澤250μg進行扳機，36 h后經(jīng)陰道B超采集卵母細胞。胚胎學家拾到卵母細胞后培養(yǎng)2～3 h，進行顆粒細胞的拆除，把成熟的卵母細胞用于ICSI。

1.2.4 胚胎培養(yǎng)及移植 ICSI結(jié)束后把授精卵子轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)觀察48～72 h。根據(jù)SART胚胎評分系統(tǒng)評分，在符合移植條件的情況下選擇培養(yǎng)3 d后的1～2枚優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植，剩余可用胚胎進行冷凍保存。移植胚胎第14天后抽取血清檢測β-HCG結(jié)果≥25 U/L或尿液HCG檢測陽性即可確診為生化妊娠。胚胎移植第35天后，經(jīng)B超檢查發(fā)現(xiàn)孕囊及心管搏動，即可確診為臨床妊娠。

1.3 觀察指標 ICSI正常受精率=2PN受精卵數(shù)/MII卵數(shù)×100%；正常卵裂率=2PN卵裂數(shù)/2PN受精卵數(shù)×100%；可利用胚胎率=(移植胚胎數(shù)+冷凍胚胎數(shù))/2PN卵裂數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN卵裂數(shù)×100%；著床率=著床胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/妊娠周期數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料不服從正態(tài)分布，用中位數(shù)和四分位間距M(P25，P75)進行描述，做兩獨立樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般資料比較 A組和B組患者的男方年齡、女方年齡、獲卵個數(shù)、成熟MⅡ卵子個數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩組患者的一般資料比較[M(P25，P75)]

2.2 兩組患者的實驗室相關(guān)指標比較 A組患者的正常受精率明顯高于B組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；但A組和B組患者的正常卵裂率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 兩組患者的實驗室相關(guān)指標比較(%)

2.3 兩組患者的臨床結(jié)局指標比較 A組和B組的著床率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表3。

表3 兩組患者的臨床結(jié)局指標比較(%)

3 討論

精子在附睪中逐步獲得了運動和受精能力，其中附睪管腔液微環(huán)境對精子的成熟和儲存起到十分重要的作用[4]。但在多種致病因素對附睪內(nèi)環(huán)境影響下，易導致精子的成熟障礙及雙側(cè)輸精管道梗阻，如射精管堵塞或先天性雙側(cè)輸精管梗阻導致精子無法通過陰道射出達到自然懷孕。在臨床上，對于以上患者的治療，傳統(tǒng)的首選治療方法是通過手術(shù)復通輸精管使其恢復輸精功能。輸精管復通手術(shù)失敗則可選擇附睪或睪丸進行穿刺取精，借助輔助生殖技術(shù)ICSI進行助孕。但是相對附睪穿刺，睪丸穿刺出現(xiàn)并發(fā)癥的風險高，且睪丸穿刺取得的精子成熟度相對欠佳或精子畸形率相對較高[5]，所以對于手術(shù)仍不能糾正的OA患者，首選取精方式為PESA。該方式的優(yōu)點是不需要切開附睪、創(chuàng)傷小、并發(fā)癥少、操作簡便、可重復取精、患者術(shù)后恢復快[6-7]，以及隨著商品化精子冷凍保護劑的出現(xiàn)和精子冷凍技術(shù)的快速發(fā)展，精子與冷凍保護劑混懸液可以在-196℃液氮下保存?zhèn)溆谩；颊呤状胃讲G穿刺檢查，如有精子則冷凍保存?zhèn)溆茫悦庵貜痛┐袒颊叩母讲G，給患者帶來不可逆的身心傷害，為OA患者后續(xù)ICSI治療提供保障。研究表明附睪精子行ICSI可獲得與正常射精精子行ICSI相同的臨床結(jié)局[8-11]。目前，關(guān)于冷凍PESA精子和新鮮PESA精子行ICSI治療OA患者的臨床結(jié)局有無差異性，國內(nèi)外相關(guān)文獻報道具有一致性，雖然個別指標會有差異性，但其最終臨床助孕結(jié)局都具有相似性。

葛斌等[12]通過分析該中心193個周期PESA精子行ICSI臨床結(jié)局比較發(fā)現(xiàn)冷凍組正常受精率、正常卵裂率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率均略低于新鮮組，差異均無統(tǒng)計學意義。余柯達等[13]研究結(jié)果表明冷凍組各項指標均偏低于新鮮組，但臨床結(jié)局比較均無差異性，以上學者認為精子在冷凍的過程中冰晶的形成對精子頂體膜的壓力增大出現(xiàn)頂體破壞，影響精子的受精能力或損傷精子的染色體。YU等[14]研究提示凍融組的正常受精率高于新鮮組，但是兩組間臨床結(jié)局比較沒有統(tǒng)計學差異性。但大多數(shù)國內(nèi)外相關(guān)文獻報道[15-18]與本研究結(jié)論相似。本研究結(jié)果表明冷凍組的正常受精率顯著高于新鮮組，兩組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。兩組間的正常卵裂率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、著床率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。雖然凍融組的受精率高于新鮮組，但是兩組間臨床結(jié)局相似，差異無統(tǒng)計學意義。正常受精率與最終助孕臨床結(jié)局有無相關(guān)性有待進一步研究。造成本研究結(jié)果的原因可能是精子凍融過程本身就是自然篩選優(yōu)質(zhì)精子的過程，能耐受低溫保存的精子多數(shù)是頂體膜功能穩(wěn)定，代謝旺盛，活力強，DNA完整性好的優(yōu)質(zhì)精子。本研究顯示無論新鮮的附睪精子還是冷凍的附睪精子行ICSI受精發(fā)育成胚胎，其胚胎在體外培養(yǎng)過程中通過自我修復功能形成優(yōu)質(zhì)胚胎，移植后取得了相似的臨床結(jié)局。

綜上所述，隨著商品化精子冷凍保護劑和冷凍技術(shù)的成熟，降低了精子在凍融過程因溫度及滲透壓改變，冰晶形成，氧化應(yīng)激反應(yīng)對精子頂體膜，線粒體膜，DNA完整性的損傷[19]。所以，對于OA患者的治療，凍融PESA精子行ICSI可獲得含自身遺傳物質(zhì)的后代，已經(jīng)得到了國內(nèi)外多家生殖中心的采納。但是還存在很多需要解決的問題，如何降低凍融過程對精子的損傷及ICSI技術(shù)的操作對出生嬰兒遠期的影響[20]，目前相關(guān)研究尚無統(tǒng)一結(jié)論，需要長期觀察。本研究的不足之處是國內(nèi)外各中心的研究樣本量均偏少，為非隨機對照研究。因此，關(guān)于冷凍PESA精子行ICSI對臨床結(jié)局的影響如何仍需大樣本多中心的臨床及基礎(chǔ)研究。本研究建議如果患者有冷凍保存的附睪精子，取卵日當天首先使用凍存的附睪精子行ICSI，如解凍后無可用精子，再重新穿刺附睪使用新鮮精子。