檳榔黃化植原體在葉片中周年消長規律探究

車海彥 曹學仁 林雅婷 羅大全

(中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所 海南海口571101)

檳榔病理性黃化病是一種由植原體引起的病害，在生產上的危害日益嚴重，危害面積逐年擴大，已成為海南檳榔種植業發展的限制因素之一。國內外研究者在檳榔病理性黃化病病原鑒定、檢測、傳播媒介和防控等方面做了許多工作［1-10］，但尚缺乏檳榔黃化植原體在葉片中的周年消長規律研究。本研究采取定點定株取樣方式，采用巢式PCR方法，研究季節變化與檳榔黃化植原體在葉片中消長的關系，同時分析黃化病田間癥狀隨季節變化的特點，以期為檳榔黃化病的綜合防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣時間和地點

2個采樣地點分別位于海南省瓊海市嘉積鎮（110.40°E，19.20°N）和 萬 寧 市 龍 滾 鎮（110.50°E，19.05°N），采樣時間為2019年2月至2020年1月每月的中下旬，樹齡均為10年。

1.1.2 試驗材料

每個檳榔園選取10株感病植株，采集植株下部倒數第2張羽狀復葉上的小葉。瓊海市和萬寧市采樣點植株樣品編號分別為QH1～10和WN1～10。健康檳榔葉片采自海南省儋州市寶島新村。

1.2 方法

1.2.1 檳榔葉片總DNA的提取

每片小葉上隨機選取3個部位，混合磨樣。采用QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit試劑盒提取檳榔葉片總DNA，提取方法詳見試劑盒說明，提取的DNA于-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 檳榔黃化植原體的檢測

檳榔黃化植原體檢測參考車海彥等［11］的方法。以本實驗室保存的含有檳榔黃化植原體的DNA樣品為陽性對照，提取的健康檳榔葉片總DNA為陰性對照，無菌雙蒸水為空白對照。以R16mF2/R16mR1［12］作為第一引物對，R16F2n/R16R2［13］作為第二引物對，進行巢式PCR（nested–PCR）檢測，引物序列見表1。引物合成委托北京六合華大基因科技有限公司。直接PCR以1.2.1中提取的總DNA為模板，將直接PCR產物稀釋50倍后作為巢式PCR的模板。

兩次PCR反應體系均為25μL，含2×TaqPCR Mastermix 12.5μL、10 μmol/L的上游引物和下游引物各1μL，DNA模板1μL和滅菌ddH2O 9.5μL。PCR反應條件為：95℃預變性3 min；95℃變性45 s，50/52℃退火45 s（退火溫度見表1），72℃延伸45 s，循環30次；72℃延伸10 min。

表1 引物序列

巢式PCR產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，用Fusion FX7 Spectra多功能成像系統觀察電泳結果。特異性片斷長度約為1 200 bp，若存在特異性片斷，檢測結果為陽性，否則為陰性。

1.2.3 溫度數據收集

從全國歷史天氣網站（http：//www.tianq‐ihoubao.com/lishi/）中獲取海南省瓊海市和萬寧市2019年2月至2020年1月的月平均溫度數據。

2 結果與分析

2.1 檳榔黃化植原體的檢測結果

檳榔黃化植原體定株檢測結果（圖1、表2、圖2）顯示，不同月份，植原體檢出率不同。瓊海采樣點植原體周年檢出率為0～100%，萬寧為0～80%。溫度較高的月份植原體檢出率遠高于溫度較低的月份，如在月平均溫度最低的12月份，20株檳榔葉片中植原體的檢出率為0。同時也發現，有些樣品檢測結果存在不穩定性，如QH8樣品，在4、5、7、10月份均檢測到植原體，但6、8、9月份未檢測到植原體。上述結果說明，植原體在檳榔葉片內的含量周年內發生消長，植原體在葉片內的含量變化與溫度有一定的相關性，檳榔黃化植原體在葉片中可能存在著分布不均勻的現象。

圖1 2019年10月份采集樣品的檳榔黃化植原體檢測結果電泳圖

2.2 檳榔黃化病田間癥狀隨季節變化情況

根據多年的觀察發現，由植原體引起的黃化病在初期會有明顯的發病中心，田間有黃化型（圖3-A）和束頂型（圖3-B）2種典型癥狀。黃化型病株在發病初期，檳榔樹倒數第2～3片葉緣1/4處開始出現黃化，植株能開花但不能正常結果，黃化癥狀逐年加重，田間感病植株大多表現此癥狀；束頂型病株的頂部葉片明顯縮小，節間縮短，田間少部分病株表現此癥狀。感染黃化病的檳榔樹只開花不結果，或者開花后花穗枯萎不能結果，或者開花后結少量品質較差的果實。

植原體引起的黃化癥狀與氣候因素關系密切，會隨季節變化而發生改變。11月至次年4月為旱季，降雨量較少，由植原體引起的黃化癥狀加重，但此時易與由干旱等因素導致的黃化癥狀相混淆。每年5～10月是海南島的雨季，由植原體引起的輕癥黃化病株葉片可能會完全轉綠，中重癥病株葉片癥狀會有所緩解，但輕癥病株葉片轉綠進程會慢于由干旱引起的葉片黃化植株。每年6月份是最容易根據田間癥狀識別檳榔黃化病的月份；此外，田間癥狀識別還應結合室內病原物的分子檢測進行綜合判斷。

表2 兩個采樣地檳榔黃化植原體周年定株檢測結果

圖2 檳榔黃化植原體檢出率和月平均氣溫關系圖

圖3 檳榔黃化病田間癥狀

3 討論

植原體在寄主體內含量和分布部位可隨季節發生一定的變動［14］。前人對幾種林木植原體的病害研究發現，植原體在冬季到來之前從地上部運轉到根部越冬，次年春天又回到地上部進行繁殖和危害，葉片內植原體含量隨氣溫升高明顯增加［15-17］。本研究中，檳榔黃化植原體病原在葉片中的檢出率總體隨著溫度升高而增加，隨著溫度的下降而減少，說明檳榔黃化植原體在病株葉片內含量周年內發生消長；在一定的溫度范圍內，葉片中植原體含量與溫度成正相關。溫度降低時可能不利于植原體在葉片內繁殖，或葉片中的植原體轉移到植株的其它部位。今后需通過進一步的實驗來明確檳榔黃化植原體隨季節變化在植株體內的分布規律。

檳榔是典型的熱帶植物，在旱季（每年11月至次年4月）缺水時，檳榔樹尤其是幼樹的葉片會表現出明顯的黃化現象，此癥狀初期與黃化病引起的葉片黃化極為相似。隨著雨季（每年5～10月）來臨，水分充足，檳榔葉片會完全恢復綠色。感染黃化病的檳榔樹，在旱季葉片黃化癥狀會加重，雨季來臨后，黃化癥狀會有所緩解，但不能像因干旱引起的黃化那樣完全恢復正常，由此可見，檳榔葉片黃化程度與水分條件存在明顯的相關性。若檳榔園內植株發生黃化現象，但又未發現明顯的發病中心，一定要結合室內分子檢測來判斷黃化現象是否為由植原體引起的病理性黃化。