miR-3127-5p靶向TRIM28調控直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲

甘建雄 李智 趙煜輝 李鵬 李雪蓮

直腸癌是最常見的惡性消化道腫瘤之一，其死亡率位居惡性腫瘤第三位，僅次于肝癌和肺癌[1]。由于發病具有隱匿性，當患者出現便血、排便習慣改變等癥狀時往往處于中晚期或發生轉移，侵襲和轉移更是導致直腸癌患者死亡的主要原因。因此，尋找新的生物標記物，開發有效的治療策略對延長直腸癌患者生存時間意義重大。據報道，多種微小RNA(microRNA，miRNA)通過誘導轉錄后基因沉默以調節細胞增殖、凋亡、遷移或藥物敏感性參與直腸癌的發生發展。例如，miR-31[2]、miR-3174[3]在結腸癌腫瘤樣本中表達上調，表現為致癌基因，而miR-144等[4]miRNA表達下調，表現為抑癌基因。miR-3127-5p是近年來發現的miRNA，既往研究表明miR-3127-5p在膠質瘤、非小細胞肺癌腫瘤樣本中表達降低，過表達miR-3127-5p可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[5,6]。然而miR-3127-5p在直腸癌中的確切生物學作用筆者所見尚未有研究。本研究通過檢測直腸癌組織樣本中miR-3127-5p的表達水平，探究miR-3127-5p在腫瘤發生中的作用，以期為直腸癌臨床診療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑 人結腸癌細胞株SW1463購于美國模式培養物保藏中心；DMEM培養液、胎牛血清購于美國Hyclone公司；TRIzol試劑、放射免疫沉淀緩沖液購于北京索萊寶公司；逆轉錄試劑盒、SYBR Green Master Mix購于大連TaKaRa公司；細胞計數試劑盒8(Cell count kit 8，CCK-8)購于日本同仁生化研究所；Transwell小室和基質膠購于美國Corning公司；兔源三結構域蛋白家族28(tripartite motif 28，TRIM28)、p21、細胞周期素D1(CyclinD1)、基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、MMP-9和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體以及山羊抗兔IgG購于美國Abcam公司；miR-3127-5p模擬物(miR-3127-5p mimics)及其陰性對照(miR-NC)、TRIM28小干擾RNA(si-TRIM28)及其陰性對照(si-NC)、空載質粒(pcDNA)、TRIM28過表達載體(pcDNA-TRIM28)的構建和測序由有南京金斯瑞公司提供。

1.2 細胞培養 將直腸癌細胞SW1463培養在含10%優質胎牛血清的DMEM培養基置于含95%空氣、5%CO2、37℃恒溫培養箱中進行培養。按照1∶3比例傳代，每周2次。

1.3 RT-qPCR檢測miR-3127-5p和TRIM28 mRNA表達 采用TRIzol試劑提取直腸癌組織、癌旁組織樣本中總RNA，并進行濃度和純度測定。利用逆轉錄試劑盒合成cDNAs，利用SYBR Green Master Mix在ABI 7500中上進行實時PCR擴增，采用2-ΔΔCt方法計算目標基因的相對表達水平。TRIM28上游引物5’-AGCGGGTGAAGTACACCAAG-3’，下游引物5’-ACCCAAAGCCATAGCCTTCC-3’；內參GAPDH上游引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，下游引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’。

1.4 細胞轉染與分組 將SW1463細胞(2×105cells/孔)接種到6孔板，當細胞融合度約為50%時，利用 Lipofectamine 3000將miR-NC、miR-3127-5p mimics、si-NC、si-TRIM28、miR-3127-5p+pcDNA、miR-3127-5p+pcDNA-TRIM28分別轉染SW1463細胞，依次記為miR-NC組、miR-3127-5p組、si-NC組、si-TRIM28組、miR-3127-5p+pcDNA組、miR-3127-5p+pcDNA-TRIM28組，轉染48 h時檢測轉染效果，進行后續實驗分析。

1.5 CCK-8實驗檢測細胞增殖活力 細胞按照實驗分組踐行干預后，胰酶消化后制成密度為3×104cells/ml的單細胞懸液，取100 μl細胞懸液加入到96孔板中，培養24、48和72 h時，每孔加入10 μl的CCK-8試劑，孵育2 h后，采用酶標儀測定各孔450 nm處吸光度值，吸光度值即為細胞增殖活力。

1.6 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 將按1∶8 稀釋的Matrigel溶液均勻包被于Transwell小室上室膜，室溫風干后備用。將Transwell小室置于24孔板中，用無血清DMEM培養基重懸各組SW1463細胞，取200 μl細胞懸液接種于上室腔；取500 μl含20%胎牛血清的DMEM培養基接種于下室腔。常規培養24 h后，用棉簽輕輕拭去上室膜細胞，采用4%多聚甲醛固定下室膜15 min，然后用5%的結晶紫溶液固定下室膜15 min。倒置顯微鏡下隨機選取3個視野拍照，記錄細胞總數，取均值表示侵襲細胞數。遷移實驗時采用未包被基質膠的Transwell小室，其他步驟與侵襲實驗相同。

1.7 Western blot檢測TRIM28、p21、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達 用放射免疫沉淀緩沖液消化各組SW1463細胞，獲得細胞蛋白。將蛋白樣品置于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳；結束后，采用濕法轉膜裝置將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉膜1 h；稀釋的一抗溶液4℃孵育膜過夜；PBS洗滌后，與稀釋的二抗結合2 h。顯影后，以GAPDH為內參，用Image J軟件分析目的蛋白相對表達水平。

1.8 雙熒光素酶報告實驗 構建含有miR-3127-5p結合位點序列的野生型(WT-TRIM28)或突變序列的突變型(MUT-TRIM28)熒光素酶報告基因載體由南京金斯瑞生物公司完成。利用Lipofectamine 3000將miR-3127-5p mimics、miR-NC分別與WT或MUT熒光素酶載體共轉染SW1463細胞。轉染48 h，雙熒光素酶報告基因測定系統測定熒光素酶活性。

2 結果

2.1 miR-3127-5p和TRIM28在直腸癌組織中的表達 相較于癌旁組織，直腸癌組織中miR-3127-5p的表達量明顯降低，TRIM28 mRNA和TRIM28蛋白的表達量明顯升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 TRIM28蛋白表達

表1 miR-3127-5p和TRIM28在直腸癌組織中的表達

2.2 miR-3127-5p過表達對直腸癌SW1463細胞增殖、遷移侵襲的影響 相較于轉染miR-NC，轉染miR-3127-5p mimics后SW1463細胞miR-3127-5p的表達顯著升高，細胞活力、遷移和侵襲細胞數顯著降低，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達顯著降低，p21蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

表2 miR-3127-5p過表達對直腸癌SW1463細胞增殖、遷移侵襲的影響

2.3 miR-3127-5p靶向調控TRIM28的表達 StarBase網站在線預測顯示miR-3127-5p與TRIM28的3’UTR之間存在互補的核苷酸序列。雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-NC和WT-TRIM28，miR-3127-5p mimics和WT-TRIM28共轉染后SW1463細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；相較于共轉染miR-NC和MUT-TRIM28，miR-3127-5p mimics和MUT-TRIM28共轉染后SW1463細胞熒光素酶活性變化差異無統計學意義(P>0.05)。Western blot結果顯示，相較于轉染miR-NC，轉染miR-3127-5p mimics后SW1463細胞TRIM28蛋白表達量顯著降低；相較于轉染anti-miR-NC，轉染anti-miR-3127-5p后SW1463細胞TRIM28蛋白表達量顯著升高同，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3、4，圖3、4。

表3 雙熒光素酶報告實驗

表4 miR-3127-5p調控TRIM28蛋白的表達

圖3 TRIM28的3’UTR中含有與miR-3127-5p互補的核苷酸序列

圖4 TRIM28蛋白表達

2.4 干擾TRIM28表達對直腸癌SW1463細胞增殖、遷移侵襲的影響 相較于轉染si-NC，轉染si-TRIM28后SW1463細胞TRIM28蛋白表達顯著顯著降低，細胞活力、遷移和侵襲細胞數顯著降低，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達顯著降低，p21蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表5，圖5。

表5 干擾TRIM28表達對直腸癌SW1463細胞增殖、遷移侵襲的影響

圖5 TRIM28和增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

2.5 TRIM28過表達逆轉了miR-3127-5p過表達對直腸癌SW1463細胞增殖、遷移侵襲的作用 相較于轉染miR-NC，轉染miR-3127-5p mimics后SW1463細胞TRIM28蛋白的表達量顯著降低，細胞活力、遷移和侵襲細胞數顯著降低，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達顯著降低，p21蛋白表達顯著升高；相較于共轉染miR-3127-5p和pcDNA，共轉染miR-3127-5p和pcDNA-TRIM28后SW1463細胞TRIM28蛋白的表達量顯著升高，細胞活力、遷移和侵襲細胞數顯著升高，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達顯著升高，p21蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表6，圖6。

圖6 TRIM28和增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

表6 TRIM28過表達逆轉了miR-3127-5p過表達對直腸癌SW1463細胞增殖、遷移侵襲的作用

3 討論

目前，全球直腸癌病情依然嚴峻。據統計，全球每年超過100萬人診斷為直腸癌，約70多萬人死于該疾病，且其年發病率呈升高趨勢，已對人類健康和公共衛生構成嚴重威脅[1]。因此，探索直腸癌發生發展的分子機制有助于對開發新的診療策略，對改善直腸癌臨床診療現狀具有重要意義。

近年來，miRNA和惡性腫瘤的相關研究對腫瘤治療提供了新的思路[7]。Yang等[8]證實非小細胞肺癌中miR-3127-5p呈低表達，且轉移性肺癌組織中miR-3127-5p的表達較原發性非小細胞肺癌組織更低，miR-3127-5p低表達可促進非小細胞肺癌細胞的上皮間質轉化、遷移和侵襲。miR-3127-5p在肝癌中也呈低表達，過表達miR-3127-5p通過誘導S期阻滯，從而抑制肝癌細胞生長[9]。本研究通過RT-qPCR檢測miR-3127-5p在直腸癌組織和癌旁組織樣本中表達差異，結果顯示直腸癌組織中miR-3127-5p表達較癌旁組織樣本顯著降低，推測miR-3127-5p在直腸癌中可能發揮抑制基因作用。通過外源性轉染miR-3127-5p mimics上調miR-3127-5p表達，直腸癌細胞株SW1463的增殖、遷移和侵襲能力顯著降低，促增殖蛋白CyclinD1、促轉移蛋白MMP-2和MMP-9表達量顯著降低，抗增殖蛋白p21表達量顯著升高。進一步證實miR-3127-5p在直腸癌中具有抑癌基因作用。

過表達miR-3127-5p可抑制SW1463細胞株的增殖、遷移和侵襲能力，但其具體作用機制并不明確。本研究通過StarBase數據庫分析發現miR-3127-5p與TRIM28的3’UTR之間存在互補堿基序列。TRIM28作為環狀結構域蛋白，是DNA損傷反應的關鍵調控因子，其還可通過抑制p53活性促進腫瘤發生[10]。研究表明，TRIM28在大腸癌[11,12]、膠質瘤[13,14]、非小細胞肺癌[15]、卵巢癌[16]等惡性腫瘤中高表達，干擾其表達可抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。此外，miR-140-3p通過靶向下調TRIM28表達還可抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移[17]。

本研究顯示，直腸癌中TRIM28亦呈高表達，提示干擾TRIM28表達可能是抑制直腸癌進展的重要機制。通過雙熒光素酶報告基因實驗和western blot檢測證實TRIM28是miR-3127-5p的下游靶基因，且miR-3127-5p負調控TRIM28表達。通過轉染si-TRIM28干擾miR-3127-5p表達，SW1463細胞株的增殖、遷移和侵襲能力顯著降低，CyclinD1、MMP-2和MMP-9表達量顯著降低，p21表達量顯著升高。進一步研究表明過表達TRIM28還可逆轉miR-3127-5p對SW1463細胞增殖、遷移侵襲的抑制作用。提示在直腸癌細胞中miR-3127-5p通過靶向下調TRIM28表達參與細胞增殖、遷移和侵襲過程。

綜上所述，miR-3127-5p在直腸癌中呈低表達，TRIM28呈高表達。過表達miR-3127-5p通過靶向抑制TRIM28表達可降低直腸癌細胞的增殖、遷移和能力。因此，miR-3127-5p有望成為直腸癌臨床診療的新靶點。