PI3K/Akt信號通路與缺血性中風的相關性研究進展

白秀 沈亞亭 王明威 張旭龍 謝西梅

缺血性中風是由于腦組織短暫或持續性的缺血、低氧而導致腦功能發生障礙的一種大腦不可逆性損傷，這一過程中伴隨著細胞凋亡、自噬、氧化應激以及炎性反應等關鍵環節的發生，PI3K/Akt信號轉導通路作為細胞內外信號應答的途徑之一，能發生一系列級聯反應串擾在這些環節中，產生錯綜復雜的有益調節作用[1,2]。然而，隨著缺血性中風病理程度的加重，這一信號通路原有的生物調節活性被抑制，信號轉導被中斷，喪失了在這一病理過程中的有益作用。近年來，隨著對這一信號通路研究的深入，發現西藥、中藥單體以及針灸等干預可重新激活這一信號通路。以下筆者對PI3K/Akt信號通路的生物學基礎，及其串擾在缺血性中風機制中的作用進行闡釋。最后總結西藥、中藥單體以及針灸對該通路已有的研究成果，為缺血性中風的防治提供理論基礎。

1 PI3K/Akt信號通路的分子生物學基礎

PI3K是存在于細胞內并能產生特異磷酸化反應的一種磷脂肌醇激酶，本身并存有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶和磷脂肌醇激酶的活性，具備多種生物學功能，在大多數組織中都有表達。因其在結構和功能上的差異，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，其中研究最多且與腦缺血關系最緊密的是Ⅰ型PI3K，由調節亞基p85和催化亞基p110構成，極易被生長因子、細胞因子等胞外信號通過表面受體(酪氨酸激酶或G-蛋白偶聯受體)激活。活化后的亞基可進一步啟動PI3K的激活，促使其發出復雜的募集運動，進而被召喚并遷移至鄰近質膜上發生磷酸化反應，使3,4-二磷酸磷脂酰肌醇 (PIP2) 轉變為3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)[3,4]。PIP3作為第二信使轉導分子繼續發揮磷酸化作用將其活化信號傳至膜內信號蛋白Akt。

Akt是一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，也是一類抗凋亡調節因子，于1977年Staal等[5]研究一種逆轉錄病毒時第一次被發現，同時因其與蛋白激酶A和C有極高的相似性,又被命名為蛋白激酶B，主要分為Akt1、Akt2、Akt3三種功能不同的亞型。其中Akt1和Akt3參與細胞的增殖、存活的過程，并對細胞的形態與數目有關鍵的調節作用[6,7]。同時，Akt作為PI3K/Akt信號通路的核心效應器，含有特殊的PH結構域，有重要的催化和調節效能，這一結構域一旦缺失或變異就可致使Akt活性低下甚至失活。依賴于PI3K的活化，Akt的PH結構域可與PI3K生成物PIP3相互識別并結合，進而使Akt從胞內遷移至胞膜上并發生構像改變，充分暴露出Ser/Thr蛋白并使其磷酸化，最終Akt徹底被激活[8,9]。活化后的Akt可進一步實現對下游底物的調控作用，引起信號轉導通路的級聯反應，對細胞的凋亡和周期產生關鍵的調節作用。

2 PI3K/Akt信號通路與缺血性中風發病機制的關系

PI3K/Akt信號轉導通路作為關鍵的級聯信號途徑之一參與了缺血性中風發生、發展過程，串擾在細胞凋亡、自噬、氧化應激及炎性反應等多種機制中，并處于核心地位。

2.1 細胞凋亡 細胞凋亡是一種細胞的程序性死亡模式，是缺血性中風中典型的病理特征之一，受多種基因的綜合調控，如Bcl-2家族、細胞色素C、Caspase家族、NF-κB家族。這一復雜模式的發生伴隨著各種信號通路的轉導，1999年的一項研究顯示PI3K/Akt信號通路參與了缺血性中風這一病理過程，且與缺血程度相關[10]。在缺血性中風發生初期，這一信號通路被激活發生一系列復雜的磷酸化級聯反應進而延緩細胞凋亡的進程[11]。這一過程主要經過以下4條途徑實現：(1)活化后的Akt可促使Bcl-2家族成員Bad的Ser136位點發生磷酸化，進而能與伴侶蛋白14-3-3結合形成復合物，與此同時，抗凋亡蛋白Bcl-2或bcl-XL形成的異源二聚體中的促凋亡蛋白Bad即可脫落下來，增加了胞內Bcl-2或bcl-XL等的游離狀態，從而發揮抗凋亡作用[12]；(2)活化的Akt在維持線粒體轉換孔自身的穩定性的同時還能抑制Bcl-2家族成員形成的線粒體跨膜通道，這樣的雙重作用可減少細胞凋亡級聯反應上游線粒體細胞色素C的釋放量從而發揮抑制細胞凋亡作用[13]；(3)活化后的Akt可磷酸化Caspase-9的Ser196 位點使其失活，進一步抑制Caspase-3下游分子發生的一系列級聯反應進而抑制細胞凋亡；(4)腦缺血發生后打破了正常狀態下Akt下游效應分子NFκB中的p50/p65/NFκB抑制蛋白(IκB)形成的三聚體復合物的穩定狀態，并在腦缺血的持續刺激下，可有效激活IκB激酶并使其進行降解，從而將p65亞基的DNA位點與p50亞基的易位信號暴露出來，導致NFκB和IκB解除聯系，經由轉位方式NFκB從胞膜轉移至胞核與DNA結合進一步啟動炎性反應加速細胞凋亡進展，活化的Akt抑制該過程的發生，維持NFκB中三聚體復合物的穩定狀態，從而抑制細胞凋亡的發展[14]。

2.2 自噬 自噬是細胞在各種應激情況下對自身的分解代謝過程。在腦缺血的發生過程中自噬有著雙重作用。缺血初期，神經細胞在缺血低氧的狀態下可激活細胞自噬進而對受損的神經細胞發揮保護效應。自噬系統激活后，其降解產物可進一步轉化合成三磷酸腺苷(APT)為受損的神經細胞提供能量。然而隨著腦缺血程度的加重，細胞自噬隨之加重，隨著自噬水平的過度增高，導致神經細胞自噬性死亡[15]。mTOR作為PI3K/Akt信號通路下游重要的靶標之一，對胞內多種信號有調控作用，并在細胞增殖分化、凋亡和自噬中扮演著重要角色。研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號通路在細胞自噬中發揮了關鍵的調節作用[16-18]。正常情況下，通過激活酪氨酸激酶受體進而激活PI3K，將其底物PIP2催化為PIP3，PIP3進一步與相應激酶協同作用激活Akt，P-Akt繼續磷酸化下游底物mTOR，活化后的mTOR將信號繼續下傳至下游相關分子，進而促進細胞增殖、分化及蛋白合成，加快細胞代謝，抑制其過度自噬。然而在腦缺血狀態的持續加重下，PI3K/Akt/mTOR信號通路的轉導能力逐漸被削弱，從而這種有效抑制被逐漸消除。有研究發現0～36 h缺血海馬神經元P-PI3K、P-Akt、p-mTOR的表達成下降趨勢，自噬相關蛋白表達成上升趨勢[19]。另有文獻報道顯示間歇性低氧可上調腦缺血后自噬水平，加重神經功能障礙程度，并表明其效應機制與抑制了PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性有關[20,21]。

2.3 氧化應激 氧化應激是由于體內活性氧和氮物質增加，氧化應激防御系統減少引起，缺血期間腦內產生大量活性氧和自由基，自由基的連鎖反應可導致神經細胞死亡，尤其對初始缺血損傷的神經細胞攻擊性更強。而在腦缺血發作初期，PI3K/Akt信號通路被激活，一方面活化后的Akt可磷酸化其下游重要靶標絲/蘇氨酸蛋白激酶GSK-3β發生磷酸化，GSK-3β是細胞內抑制糖原合成的激酶，可調控線粒體轉換孔及NFκB發揮作用，磷酸化的GSK-3β失去了增加ATP的釋放和激活NFκB的能力，從而減輕氧化應激對腦組織的損傷。另一方面活化后的Akt可進一步活化具有激活氧化應激防御機制作用的核因子E2相關因子2(Nrf2)，從而影響Nrf2與其調節路徑Keap1偶聯，并使Nrf2轉移至胞核內，識別并結合抗氧化基因啟動子ARE，從而增強醌氧化還原酶1(NQO1)、血紅素加氧酶1(HO-1)等抗氧化蛋白的表達，減輕缺血再灌注對神經細胞的損傷程度[22]。

2.4 炎性反應 在缺血性中風的病理過程中，炎性反應引起的過度免疫反應是神經細胞損傷的重要機制。該病的發生必然伴隨著活性氧的產生，活性氧可促使炎癥細胞活化并釋放大量炎性因子入血，目前的主流觀點認為腫瘤壞死因子TNF-α和白介素代表因子IL-6作為中心炎性介質入血后導致白細胞過度激活、血管內皮細胞以及白細胞表面黏附分子的表達增加，這些不利因素都增加了神經細胞的廣泛損傷，促使繼發性腦損傷的進展。大量文獻報道顯示，內皮型一氧化氮合酶eNOS作為Akt磷酸化后下游的關鍵底物之一，依賴于Akt的活化發生磷酸化，進一步生成NO，NO作為一種內皮細胞松弛因子，廣泛存在于腦組織中，一方面能夠有效緩解缺血性中風急性發病時血壓急劇升高導致顱內血管痙攣、閉塞甚至血腫等不利情況，發揮保護效應；另一方面NO能夠減輕炎性介質對神經細胞的浸潤程度，降低白細胞和血小板在細胞壁上的粘連程度，促進血管重構，從而適應缺血缺氧的生理環境，產生腦保護作用[23-26]。此外，活化后的Akt還能抑制其下游另一效應介質NFκB介導的炎性反應，從而延緩神經細胞凋亡進程。

3 PI3K/Akt信號通路的轉導及干預對缺血性中風的影響

生理條件下，PI3K/Akt信號通路作為機體經典的促增殖、抗凋亡途徑，活化的PI3K/Akt在保證神經元正常功能及維持正常凋亡水平方面有著至關重要的作用。研究證實，在腦缺血再灌注的病理損傷過程中PI3K/Akt通路的轉導活性逐漸被抑制，通過干預觸發并激活該通路，可扭轉過度凋亡趨勢，從而使腦缺血再灌注損傷程度有所減輕[27]。

3.1 西藥對PI3K/Akt信號通路的影響 迄今為止，西藥一直是臨床治療缺血性中風的主要方法，但西藥的藥理作用極為復雜，涉及面極為廣泛。近十年來，關于西藥在信號通路的探索取得了一定突破。有報道顯示δ-阿片受體激動劑(DADLE)作為一種新型神經保護劑，通過激活Gi/Go偶聯的δ-阿片受體刺激Akt信號，再者該受體還可通過酪氨酸蛋白激酶(Src)依賴的胰島素樣生長因子(IGF-1)受體的反式激活調節PI3K，一方面加速促凋亡蛋白Bad磷酸化失活，另一方面促使抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而達到抗神經細胞凋亡作用[28-30]。另有學者利用LY294002驗證丁基苯酞是否通過對PI3K/Akt/GSK3β信號通路的調節起到保護局部腦損傷的作用機制的研究中發現，丁基苯酞可介導PI3K來實現Akt和GSK3β的磷酸化進程，降低受損腦組織中神經細胞的凋亡水平，同時在后期參與修復過程，對于缺血后腦梗死的面積的擴大有抑制作用[31]。此外，相關實驗顯示維甲酸α受體激動劑Am80可促使Bcl-2蛋白表達，抑制Bax蛋白表達，提高Akt的磷酸化水平，并在使用PI3K抑制劑Wortmannin后可阻斷Am80的作用[32]。說明維甲酸α受體激動劑Am80的神經保護機制可能是介導PI3K/Akt信號通路達到的。另有研究者在建立局灶性腦缺血再灌注大鼠模型后，經股靜脈給與右美托咪定干預，檢測分析結果顯示，缺血區腦組織中p-Akt(Ser473)、內皮型一氧化氮合酶p-eNOS(Serl177)的表達水平上調，為取得進一步驗證，給與PI3K阻斷劑LY294002或內皮型一氧化氮合酶(eNOS)阻斷劑L-NIO后發現，右美托咪定干預的原有趨勢被逆轉[33]。表明右美托咪定可經上調PI3K/Akt,促使eNOS磷酸化激活進而減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷程度。

3.2 中藥單體對PI3K/Akt信號通路的影響 目前,國內外學者關于中藥活性單體在缺血性中風的動物實驗中發現，各種中藥活性單體可直接或間接作用于PI3K/Akt信號通路發揮其神經保護作用。有學者在研究槲皮素的神經保護機制時發現槲皮素可顯著改善MCAO大鼠神經功能，降低梗死體積，并增加了大鼠腦部缺血區域腦源性神經營養因子(BDNF)、p-Akt蛋白表達，而PI3K抑制劑LY294002或受體拮抗劑可阻斷槲皮素誘導的大鼠相同腦缺血部位BDNF和p-Akt蛋白的升高[34]。認為槲皮素能降低缺血后腦組織損傷程度，其機制可能與激活PI3K/Akt信號通路有關，并有望成為未來腦缺血后發揮神經保護效應的潛在藥物。另有實驗發現，具有抗氧化和抑制凝血酶作用的羥基紅花黃色素A(HSYA)可增加腦缺血大鼠缺血半影區Akt和GSK3β的磷酸化程度，并對此缺血區細胞凋亡數目有明顯的下調作用[35]。表明HSYA有一定的腦保護作用，其效應機制可能是通過PI3K/Akt/GSK3β信號途徑實現的。此外，有研究顯示，紅景天苷可降低腦缺血模型大鼠腦組織細胞凋亡水平，促使該缺血區p-Akt、Bcl-2、神經營養因子(BDNF)和HO-1的表達，降低炎癥相關因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表達，且前后這兩種表達趨勢都可被LY294002逆轉[36]。這說明紅景天苷的神經保護的分子機制可能與PI3K/Akt信號途徑的激活有關。另有學者研究發現姜黃素可減輕腦缺血再灌注大鼠血腦屏障通透性及腦水腫，抑制細胞凋亡，提高PI3K、Akt蛋白活性，增加Bcl-2蛋白表達,降低Bax蛋白表達，這說明姜黃素的腦保護作用是通過穿透血腦屏障后激活PI3K/Akt信號通路產生的[37]。

3.3 針灸對PI3K/Akt信號通路的影響 針灸作為一種外源性刺激療法一直是治療缺血性中風的中醫有效手段之一，歷史悠久，療效確切，目前得到了國內外學術界廣泛認可。近年來，隨著新技術新方法的不斷涌現，該領域逐漸深入到細胞、分子層面，其中關于細胞內信號轉導的研究引起了廣泛關注，尤其是涉及PI3K/Akt信號通路的研究逐漸增多。有研究者以神經細胞凋亡為著眼點觀察不同時機介入針刺法對幼鼠腦缺血后PI3K/Akt信號通路的影響，發現不同時間介入針刺治療都可降低細胞凋亡數量，上調PI3K、Akt的表達，下調Caspase-3的表達，并表明早期干預效果更佳[38]。提示針刺可加強PI3K/Akt信號通路的激活，抑制神經細胞凋亡，對缺血腦損傷幼鼠的神經具有保護作用。有學者研究發現針刺醒腦開竅針法主穴人中、內關、三陰交可改善腦缺血大鼠缺血海馬組織病理損害程度，降低海馬組織細胞凋亡數量，而在該缺血海馬組織檢測到p-Akt、Bcl-2蛋白呈現高表達[39]。提示醒腦開竅針法在腦缺血損傷過程中的保護作用可能與PI3K/Akt信號通路的激活有一定聯系。另有文獻報道顯示，對腦缺血大鼠進行電針干預后缺血腦組織中PI3K、p-Akt、Bcl-2的表達量增加，Caspase-3陽性表達受到抑制，并在阻斷此通路后，p-Akt、Bcl-2表達消失，電刺激和針刺的有益效應被削弱[40-42]。表明電針的正性調節作用可能與PI3K/Akt信號通路的激活密切相關。認識到針灸對這一信號途徑的有益調節作用后，相關實驗在使用三七總皂苷(PNS)的基礎上疊加針灸療法觀察對急性缺血性大鼠的神經行為學情況及血腦屏障的保護作用，結果顯示對比單純使用PNS治療，針藥聯合治療效果更佳，且PI3K/Akt信號途徑相關分子的表達情況較單純使用PNS更可觀[43]。表明PNS結合針灸對急性缺血性大鼠有顯著的腦保護作用，其效應機制可能與激活PI3K/Akt信號通路并加強其轉導有關。以上從PI3K/Akt信號通路角度探討了針灸在腦缺血中效應機制，初步得出結論：針灸可借助對PI3K/Akt的調控作用進而對腦缺血導致的腦損害發揮了一定的保護作用，間接表明針灸經絡與細胞內信號轉導之間存在一定聯系。

PI3K/Akt信號通路作為生物體內重要的轉導通路，在維持生物體內正常代謝平衡外，同時參與多種疾病的病理過程。缺血性中風是由多種病理因素共同作用而形成，PI3K/Akt信號通路作為細胞生存的關鍵途徑之一在該病發生、發展進程早期被激活，并串擾缺血后誘導的細胞凋亡、自噬、氧化應激及炎性反應等重要機制中，發生一系列級聯反應進而啟動對受損的神經細胞的產生保護作用，然而隨著缺血程度的加重其活性逐漸被抑制導致神經細胞的凋亡加速發展。此外，目前國內外針對PI3K/Akt信號通路在缺血性中風的靶向研究中發現，內源性的西藥、重要單體作用和外源性的針灸刺激可重新激發并喚醒這一信號通路，使其恢復原有的信號轉導能力，從而進一步發揮對神經細胞的有益效能，這為治療缺血性中風提供了新的靶點。