老年人胰腺癌組織中HER2表達及臨床意義

崔自強 竇劍 高慶軍 趙鑫 姜翀弋 曹經(jīng)琳 王巍

胰腺癌起病隱匿，早期無明顯癥狀和體征，少數(shù)早期胰腺癌患者僥幸因定期體檢發(fā)現(xiàn)，而多數(shù)因為有黃疸或者腹痛等癥狀就診的胰腺癌多數(shù)已經(jīng)晚期。胰腺癌侵襲強，極容易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，是惡性程度極高的腫瘤之一，發(fā)病率與致死率接近，5年生存率非常低[1]。胰腺癌常見于老年人，隨著我國人口老齡化的進展，胰腺癌越來越成為影響人民生命健康的重大公共衛(wèi)生問題。人類上皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)是人表皮生長因子受體家族成員之一，HER2蛋白具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體，在細胞增殖、分化和生存的過程中起重要的調(diào)節(jié)作用，在多種實體腫瘤(如乳腺癌、胃癌等)的發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮重要作用。鑒于HER2過表達對胰腺導管腺癌有診斷和預測預后的意義，且在老年人胰腺導管腺癌中過表達率顯著高于中青年患者[1]。本研究以病理材料為基礎(chǔ)，利用免疫組化Envision二步法檢測HER2蛋白在接受根治性切除術(shù)的老年人胰腺導管腺癌患者標本中表達情況，分析HER2表達與臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2002年1月至2011年12月復旦大學附屬華東醫(yī)院普外科接受根治性手術(shù)經(jīng)病理確診的≥60歲老年人胰腺導管腺癌病例67例。其中男36例，女31例；年齡60～82歲，平均年齡(68.03±5.69)歲，中位年齡66.00歲。腫瘤位置：胰頭部41例，胰體尾部26例；病理分級：高分化8例，中分化44例，低分化15例；參照2019年WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類：T1期10例，T2期39例，T3期18例；N0期40例，N1期和N2期共27例；神經(jīng)侵犯28例，切緣陽性病例13例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，選取石蠟保存完整并可再次利用取材的病例，最終20例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶入組。16例>60歲老年正常胰腺組織取自2010年01月到2012年12月在華東醫(yī)院普外科因為其他疾病行胰腺十二指腸切除術(shù)或胰體尾切除術(shù)的患者。本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查批準。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①病理診斷為胰腺導管腺癌；②年齡≥60歲；③經(jīng)胰腺癌根治性手術(shù)。

1.2.2 排除標準：①腫瘤有遠處轉(zhuǎn)移；②腫瘤侵犯腹腔干或腸系膜上動脈；③圍手術(shù)期死亡。

1.3 方法 兔抗人多克隆HER2抗體、GT1009系列抗體稀釋液和GTVisionⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒均購自DAKO公司。pH值6.0檸檬酸緩沖工作液、pH值9.0 PBS緩沖液、蒸餾水均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。選擇合適蠟塊，切片厚度4 μm，1片置于普通載玻片，另選1切片置于潔凈的涂膠載玻片上，放置于60℃ 1 h干燥，普通載玻片行HE染色，對涂膠載玻片應用免疫組化Envision二步法染色。首先，對涂膠載玻片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蒸餾水沖洗。然后，3%過氧化氫溶液孵育30 min，消除內(nèi)源性過氧化酶活性，蒸餾水沖洗。再入pH值6.0檸檬酸緩沖工作液，于99℃水浴30 min，自然冷卻，蒸餾水沖洗。再行PBS沖洗，每次5 min，3次。然后滴入HER2一抗(1∶300)37℃孵育1 h。再行PBS沖洗，每次5 min，3次。使用Envision試劑，37℃ 1 h。然后二抗37℃孵育30 min。再行PBS沖洗，每次5 min，3次。然后DAB顯色3～5 min(顯微鏡下控制)，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，烘干。最后二甲苯透明，中性樹脂封片。由病理科醫(yī)生讀片，參考Hercep Test評分判定標準[2]進行評定，并記錄結(jié)果。

1.4 HER2蛋白表達參考HercepTest評分判定標準進行評定 陽性細胞為細胞膜染色，并根據(jù)細胞膜染色程度和所占的比率進行分級，其中細胞膜染色細胞所占比率<10%為0；細胞膜染色為淡黃色，所占比率≥10%為1+；細胞膜染色為黃色，所占比率≥10%為2+；細胞膜染色為棕黃色，所占比率≥10%為3+。定義2+～3+為過表達。

2 結(jié)果

2.1 老年人胰腺導管腺癌與正常胰腺組織中HER2表達情況 67例老年人胰腺導管腺癌中，有19例HER2蛋白表達為0，22例1+，16例2+，10例 3+，過表達者共26例，過表達率占38.8%。在16例老年人正常胰腺組織中HER2表達0、1+分別為13例和3例，無過表達者，過表達率為0。老年人胰腺癌組織中HER2過表達率顯著高于老年人正常胰腺組織，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)。見表1。

表1 老年人胰腺導管腺癌和正常胰腺組織中HER2蛋白表達情況 例(%)

2.2 老年人胰腺導管腺癌中HER2表達與臨床病理特征的關(guān)系 在67例患胰腺導管腺癌的老年患者中，男36例，過表達18例(50.0%)；女31例，過表達8例(25.8%)，男性過表達率顯著高于女性(P=0.043)。所有患者中，腫瘤中分化者和低分化者過表達率分別為40.9%和40.0%，兩者幾乎相同；腫瘤高分化者過表達率為25.0%，低于前兩者，但差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.693)。根據(jù)2019年WHO消化系統(tǒng)腫瘤分期，進行T分期和N分期，入組病例中無T4分期，因為T分期高度依賴腫瘤大小，故T分期也基本反映腫瘤大小。在67例患胰腺導管腺癌的老年患者中，T1期10例，過表達5例，過表達率為50.0%；T2期39例，過表達14例，過表達率為35.9%；T3期18例，過表達7例，過表達率為38.9%；T1期胰腺導管腺癌HER2過表達率高于T2期和T3期，但差別均無統(tǒng)計學意義(P=0.717)。因為所涉及病例中N2分期僅有1例，故將N1期和N2期合并。N0期40例，過表達者16例，過表達率為40.0%；N1+N2期27例，過表達10例，過表達率為37.0%，N0期胰腺導管腺癌HER2過表達率略高于N1+N2期，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.807)。在老年人胰腺導管腺癌HER2過表達率與性別相關(guān)，男性過表達率顯著高于女性，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P=0.043)，但與腫瘤部位、腫瘤分級、T分期、N分期、神經(jīng)侵犯、切緣陽性無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 老年人胰腺導管腺癌組織中HER2蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.3 老年人胰腺導管腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中HER2表達 20例胰腺導管腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中，HER2蛋白無表達者5例，表達1+者11例，表達2+者3例，表達3+者1例，分別占25.0%、55.0%、15.0%和5.0%。其中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中HER2表達2+/3+者共4例，過表達率為20.0%。見表3。

2.4 老年人胰腺導管腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中HER2表達與原發(fā)灶比較 胰腺導管腺癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中HER2表達同為0/1+者11例，同為2+/3+者1例，表達一致者占60.0%；胰腺導管腺癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中HER2表達不同者共8例，占比40.0%。未發(fā)現(xiàn)老年人胰腺導管腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中HER2表達與原發(fā)灶相關(guān)(P=0.727)。見表4。

3 討論

胰腺癌起病隱匿，發(fā)病早期無典型癥狀，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是晚期，且胰腺癌惡性程度極高，極容易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，故致死率與發(fā)病率非常接近。據(jù)報道，胰腺癌5年總生存率僅約10%[3]，此數(shù)據(jù)遠低于其他實體腫瘤。隨著我國人口老齡化加劇、生活方式及飲食習慣的改變，胰腺癌的發(fā)病率必將增加，勢必成為影響國民生命健康的公共衛(wèi)生問題[4]。據(jù)Rahib等[5]的推測，到2030年在西方國家胰腺癌可能將成為惡性腫瘤中的第二位死因，胰腺癌通常發(fā)生于老年人，其發(fā)病率最高的年齡段是60～80歲[6]。跟很多實體腫瘤一樣，胰腺癌的發(fā)病與人體衰老關(guān)系密切，對老年人胰腺癌分子生物學和臨床病理特征的研究，將有助于我們進一步了解胰腺癌的發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，從而為其防治提供新的思路[7]。基于上述原因，本研究以67例≥60歲老年人胰腺導管腺癌的病理石蠟為對象，應用免疫組化Envision二步法，依據(jù)Hercep Test評分判定標準進行評定HER2表達的情況，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。

HER2基因由Shih提出[8]。人HER2基因定位于染色體17q21，分子量約為185 kU，作為人表皮生長因子受體家族成員之一，HER2蛋白是具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體，并在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和生存的過程中發(fā)揮重要作用[9]。由于HER2缺乏特異性配體，在某些特定條件情況下，過度表達的HER2可與自身或與家族其他成員形成二聚體，進而發(fā)生自身磷酸化和磷酸化其他成分，最終激活Ras蛋白。通過TPK-Ras-MAPK途徑，催化細胞核內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化，導致基因轉(zhuǎn)錄或關(guān)閉，并最終調(diào)節(jié)細胞分裂和分化[10]。

HER2過表達與多種實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤的診治相關(guān)。研究顯示，HER2在乳腺癌中過表達率為20%～30%，HER2過表達的乳腺癌病例預后差，對化療和激素治療不敏感，過表達是患者預后差的獨立危險因子[11]，針對乳腺癌HER2的靶向治療取得了較好的結(jié)果，并被列入臨床診治指南。在胃癌中，HER2過表達率為7%～34%[12]。胃癌中HER2過表達率相差較大，原因可能與所用試劑和評分體系不同有關(guān)，到目前為止，胃癌尚未有統(tǒng)一的HER2評分系統(tǒng)。盡管胃癌的過表達率相差較大，但針對HER2的靶向治療(如赫賽汀)在胃癌中已經(jīng)進入臨床診治指南。HER2在部分實體腫瘤(特別是乳腺癌)的診治過程中的革命性的改變，為其他實體腫瘤(包括胰腺癌)帶來了希望。Harder等[13]對17例胰腺癌患者采用聯(lián)合曲妥珠單抗和卡培他濱進行治療，結(jié)果顯示，12周后無病生存患者占23.5%，總生存期中位數(shù)為6.9月。盡管無病生存期和總生存期并沒有比標準化療顯著提高，但胰腺癌患者對曲妥珠單抗表現(xiàn)出很好的耐受性。臨床試驗證明了針對HER2靶向治療的安全性。除此之外，針對HER2的免疫治療也初步顯示了可喜的進展，比如，CAR-T療法治療HER2陽性的胰腺癌Ⅰ期臨床試驗，已證明安全性和較好的臨床結(jié)果[14]。

在胰腺癌HER2表達的研究也有不少。Safran等[15]研究顯示胰腺癌組織中HER2蛋白過表達率為21%，其中可根治切除者、有局部浸潤者和有遠處轉(zhuǎn)移者的過表達占率分別為16%、17%和26%，隨著胰腺癌分期的越來越晚，HER2過表達率也逐漸增加。因而Safran等認為患者HER2蛋白表達在不斷增加也提示著胰腺癌患者病情的逐步惡化。Komoto等[16]對129例無遠處轉(zhuǎn)移、無腹腔播散的胰腺導管腺癌的根治性切除腫瘤標本進行了免疫組化，發(fā)現(xiàn)HER2蛋白過表達者占61.2%，過表達者中位生存時間為14.7個月，顯著低于正常表達者的20.7個月，因此，胰腺癌患者HER2蛋白過表達提示預后差。Koka等[17]對308例胰腺癌病例進行免疫組化，結(jié)果僅48例HER2過表達者，過表達率為16%，胰腺癌HER2過表達者平均生存期為11個月，正常表達者生存期為7個月。這個結(jié)果與Komoto等[16]研究結(jié)果相反。前人對胰腺癌HER2表達的研究中，過表達率相差甚多，我們認為可能與所用試劑、免疫組化方法和評分體系不同有關(guān)。規(guī)范的檢測仍需要大量的實驗去積極探索。在前期，我們對109例接受根治性手術(shù)經(jīng)病理確診的胰腺導管腺癌病例進行研究，利用免疫組化Envision二步法檢測HER2蛋白，參考HercepTest評分判定標準進行評定，我們發(fā)現(xiàn)胰腺癌中HER2過表達占34.9%，HER2表達強陽性的患者術(shù)后生存期明顯延長，并且發(fā)現(xiàn)老年人胰腺癌組織中HER2過表達率明顯增高[1]。另外胰腺癌患者發(fā)病時多為老年人。基于上述兩點，我們將研究進一步深入，專門研究老年人胰腺癌HER2表達的規(guī)律。

本研究針對67例60歲以上有明確診斷的胰腺導管腺癌病例，且均為無遠處轉(zhuǎn)移、無血管侵犯的根治性標本，所得結(jié)果為在67例老年人胰腺導管腺癌組織中HER2表達0、1+、2+、3+分別占28.4%、32.8%、23.9%和14.9%，過表達率為38.8%，略高于我們先期報道的所有年齡段胰腺癌HER2的過表達率(34.9%)[1]。但仍在Aumayr等[18]報道的胰腺癌HER2蛋白過表達率(4%～50%)的范圍內(nèi)。本研究結(jié)果顯示，作為對照組的16例正常胰腺組織未見HER2過表達者，與胰腺導管腺癌HER2表達有顯著差別(P=0.003)。我們認為，對于60歲以上人群，HER2過表達可作為胰腺正常組織和胰腺導管腺癌組織的區(qū)分標志。老年人胰腺導管腺癌組織中HER2蛋白表達與性別顯著相關(guān)(P=0.043)，男性患者HER2過表達率高于女性患者。這一結(jié)論在既往的研究中未提及。但有關(guān)HER2表達與性別相關(guān)機制的研究亦未發(fā)現(xiàn)。在67例患胰腺導管腺癌的老年患者中，腫瘤位于胰頭者41例，過表達15例，過表達率為36.6%；腫瘤位于胰腺體尾部者26例，過表達11例，過表達率為42.3%。胰腺體尾部的胰腺導管腺癌HER2過表達率略高于胰頭部，但兩者無顯著差異(P=0.640)。在67例患胰腺導管腺癌的老年患者中，腫瘤高分化者、中分化者、低分化者HER2過表達率分別為25.0%、40.9%和40.0%，中分化者與低分化者HER2過表達率幾乎相同，均高于高分化者，但差別均無統(tǒng)計學意義(P=0.693)。本研究根據(jù)2019年WHO消化系統(tǒng)腫瘤分期，進行T分期和N分期，因為T分期高度依賴腫瘤大小，故T分期也基本反映腫瘤大小，故本研究未再行HER2過表達率與腫瘤大小的相關(guān)性分析。本研究顯示，T1期、T2期和T3期胰腺導管腺癌HER2過表達率分別為50.0%、35.9%和38.9%，T1期胰腺導管腺癌HER2過表達率高于T2期和T3期，但差別均無統(tǒng)計學意義(P=0.717)。N0期、N1+N2期胰腺導管腺癌HER2過表達率分別為40.0%和37.0%，N0期胰腺導管腺癌HER2過表達率略高于N1+N2期，差別無統(tǒng)計學意義(P=0.807)。Tsiambas等[19]對50例胰腺導管腺癌組織研究，結(jié)果顯示過表達者占20%，認為HER2蛋白表達與腫瘤分級相關(guān)，與分期無關(guān)。而在次研究中未發(fā)現(xiàn)HER2過表達與腫瘤分級、腫瘤分期相關(guān)。在我們研究的胰腺癌中，腫瘤無神經(jīng)侵犯有39例，過表達17例，過表達率為43.6%；腫瘤侵犯神經(jīng)者28例，過表達9例，過表達率為32.1%，低于無神經(jīng)侵犯者，但兩者無顯著差別(P=0.343)。胰腺癌的神經(jīng)侵犯提示胰腺癌惡性程度高，容易擴散。盡管有無神經(jīng)侵犯與HER2過表達率無顯著差別，但本次研究中無神經(jīng)侵犯者HER2過表達率更高，似乎預示著胰腺癌HER2過表達率高者惡性程度低。既往認為，手術(shù)切緣陽性是術(shù)者手術(shù)切除不徹底所導致，與其他因素無關(guān)。但隨著手術(shù)技術(shù)的進步和腫瘤生物行為的深入研究，發(fā)現(xiàn)有些腫瘤手術(shù)切緣陽性與其本身具有特殊的生物學行為相關(guān)，故我們將手術(shù)切緣列為研究對象。本研究中手術(shù)切緣陰性者54例，過表達23例，過表達率為42.6%；手術(shù)切緣陽性者13例，過表達3例，過表達率為23.1%。手術(shù)切緣陽性的胰腺導管腺癌HER2過表達率低于手術(shù)切緣陰性者，但兩者無顯著差別(P=0.195)。總之，在老年人胰腺導管腺癌HER2過表達率與性別相關(guān)，男性過表達率顯著高于女性，兩者有統(tǒng)計學差異(P=0.043)，但與腫瘤部位、腫瘤分級、T分期、N分期、神經(jīng)侵犯、切緣陽性無明顯相關(guān)性(P>0.05)。本研究對老年人胰腺導管腺癌組織HER2表達與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中HER2表達分析，未發(fā)現(xiàn)老年人胰腺導管腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中HER2表達與原發(fā)灶相關(guān)(P=0.727)。說明在胰腺癌病灶轉(zhuǎn)移的過程中，HER2表達的情況也可能發(fā)生變化。

本研究樣本量較小，均為胰腺癌根治術(shù)后的標本，可行胰腺癌根治術(shù)的病例腫瘤分期多數(shù)為Ⅰ期和Ⅱ期，分期較早，且為單中心研究，存在一定的選擇偏倚。部分病理取材時所取淋巴結(jié)數(shù)目較少，未達到15個，影響N分期，可能會影響胰腺導管腺癌HER2表達與N分期的關(guān)系。

綜上所述，胰腺導管腺癌是常見的且惡性程度極高的腫瘤，通常發(fā)生于老年人，HER2過表達在胰腺導管腺癌病例中占一定比例，HER2表達在部分胰腺導管腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起重要作用。另外，在老年人胰腺導管腺癌組織中HER2表達有其特殊之處，老年患者的胰腺導管腺癌HER2過表達率可能與性別有關(guān)，老年男性胰腺導管腺癌組織中HERE2過表達高于老年女性患者，但其機制需進一步研究。