p16、Ki-67和P53在高級別宮頸鱗狀上皮內病變精準診斷中的價值

王慧香，徐孟宇，余 暉，許 濤，李 岳

(首都醫科大學附屬北京同仁醫院 婦產科，北京100730)

宮頸鱗狀上皮內病變(squamous intraepithelial lesion,SIL)是宮頸鱗狀細胞癌(cervical squamous cell carcinoma,SCC)癌前病變，準確識別、精準治療高級別宮頸鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)是SCC防治重點。臨床病理診斷工作中，老年性宮頸萎縮性改變、鱗狀上皮化生及鱗狀上皮良性增生與SIL的鑒別常存在一定的困難，SIL的級別判定缺少客觀依據。研究表明，高級別宮頸鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)診斷中，不同病理學家診斷一致性只有27.6%[1]。因此迫切需要尋找一些與診斷不同級別宮頸病變相關的、可靠的生物學標志物。

P16作為一種抑癌基因直接參與細胞周期的調控，負調節細胞增殖及分裂，一旦失活則會導致細胞惡性增殖，P16基因以缺失、突變方式廣泛參與腫瘤形成[2],P16的表達與宮頸高度病變、宮頸癌等具有重要關聯性[3]。Ki-67是一種細胞增殖標記物，作為核增殖抗體可用于腫瘤和反應性增生病變的鑒別。Ki-67表達于G0期以外處于其他細胞周期的細胞，可判斷細胞的增殖活性，是確定良、惡性組織生長狀態的重要標記物。郭曉寧等報道[4]，P16和Ki-67在SCC、HSIL、LSIL組中表達明顯高于宮頸炎組，在SCC和HSIL組表達明顯高于LSIL組。但仍有一些病例雖為HSIL，但不表達P16和Ki-67[5]。抑癌基因P53受到致癌因子攻擊發生突變后，不但喪失正常功能，還有致癌作用。研究發現，許多腫瘤在癌前病變期和腫瘤早期存在P53基因突變[6-7]。本文擬探討p16、Ki-67、P53蛋白在不同級別SIL中的表達情況及其相關性，提高HSIL準確診斷率。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2015年3月-2018年3月首都醫科大學附屬北京同仁醫院陰道鏡直視下宮頸活檢病理標本共180例為研究對象，依據常規HE染色病理切片，病理診斷經2名經驗豐富病理科醫師分別閱片后共同確診。依據《2014年第四版女性生殖器官腫瘤WHO分類》診斷標準，根據病理組織學診斷結果分為HSIL組60例，LSIL組60例；選取60例宮頸炎病例作為對照組。入組病人年齡在22-64歲，平均42.5歲，各組病人年齡差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 排除標準① 妊娠期和哺乳期女性；② 患有自身免疫性疾病；③患有其他惡性腫瘤；④既往有子宮切除術病人。

1.3 檢測方法所有標本經4%中性甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，3-4 μm連續切片，分別進行HE染色和SP法免疫組化染色封片。以PBS溶液代替一抗作為陰性對照。濃縮型鼠抗人P16單克隆抗體、Ki-67單克隆抗體及P53抗體均購自美國Abcam公司。

1.4 結果判定在病理顯微鏡下，瀏覽整個切片后，選擇病變最典型、陽性表達最強的部位，盡可能包含上皮層和基底層。參照Shi和Pinto等半定量評價標準：① P16以細胞核和/或細胞質著棕黃色顆粒為陽性，無者為(-)；棕黃色顆粒為(+)，棕黃色粗顆粒為(++)，棕褐色粗顆粒為(+++)。② P53和Ki-67以細胞核出現明顯的棕黃色顆粒為陽性，陽性細胞僅位于基底層及副基底層，陽性細胞百分率=陽性細胞數/計數細胞數。陽性細胞數≤5%為(-),6%-25%為(+),26%-50%為(++),50%-75%為(+++)，>75%為(++++)。本研究以陽性強度在(+)以上者列為陽性表達；(-)為0分，(+)為1分，(++)為2分，(+++)為3分。也可以采用陽性細胞在鱗狀上皮垂直面分布比例標記，基底及基底旁細胞陽性為(+)，下1/3以內細胞著色為(++)，1/3-2/3細胞著色為(+++)，超過下2/3細胞著色為(++++)。本研究以陽性強度在(+)以上者列為陽性表達；(-)為0分，(+)為1分，(++)為2分，(+++)為3分，(++++)為4分。

1.5 統計學分析采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。計量資料采用“均數±標準差”表示，陽性率組間比較采用卡方檢驗或者確切概率法，使用靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值等指標評價診斷試驗效能，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p16在不同級別宮頸病變中的表達在宮頸鱗狀上皮細胞核/漿內出現棕黃色顆粒判定為p16表達陽性。在宮頸炎組、LSIL組、HSIL組中p16的陽性表達率隨宮頸病變級別的升高呈上升趨勢，三組間表達差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 p16在不同級別宮頸病變中的表達情況

2.2 Ki-67在不同級別宮頸病變中的表達Ki-67主要表達于宮頸鱗狀上皮細胞核，為棕黃顆粒狀沉積。不表達或“+”表達均判定為陰性。Ki-67在宮頸炎組、LSIL組、HSIL組間表達陽性率存在明顯差異(P<0.01)，并隨宮頸病變級別的升高Ki-67表達呈上升趨勢，見表2。

表2 Ki-67在不同級別宮頸病變中的表達情況

2.3 P53在不同級別宮頸病變中的表達P53主要表達于宮頸鱗狀上皮細胞核，為棕黃顆粒狀沉積。在宮頸炎組、LSIL組、HSIL組中P53的陽性表達率隨宮頸病變級別的升高呈上升趨勢，三組間表達陽性率差異有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 P53在不同級別宮頸病變中的表達情況

2.4 p16、Ki-67和P53診斷高級別宮頸上皮內病變的效能評價

分別以“+”、“++”、“+++”作為切入點，計算各指標診斷HSIL的靈敏度和特異度，通過比較，本實驗選擇陽性表達“++”為切入點進行下一步統計學分析；通過并聯(即平行試驗，當檢測指標中每一個為陽性即可診斷為陽性)、串聯(即系列試驗，當檢測指標中每一個均為陽性方可診斷為陽性)進一步評價診斷效能。結果顯示：單獨使用p16和P53靈敏度和特異度診斷效能均較高；但在單獨應用Ki-67作為標志物時，通過串聯方式，聯合應用p16和P53可提高HSIL診斷的特異性，見表4。

表4 三種生物學指標單獨或聯合檢測診斷HSIL的效能評價表(%)

3 討論

宮頸鱗狀細胞癌的發生是一個較為漫長的過程，在這個過程中存在著多種基因和蛋白的變化，作為SCC癌前病變的SIL被區分為LSIL和HSIL，其中LSIL大部分可自然消退，而HSIL具有癌變潛能，可發展為SCC，因此精準診斷并及時治療HSIL至關重要。由于LSIL和HSIL在組織形態上為連續病變，并無截然的分界線，加上病理科醫生的主觀判斷存在差異，因此存在過度診斷和漏診等情況。研究表明，在LSIL(宮頸上皮內瘤變Ⅰ級)中，只有64%的病理診斷相同；在HSIL(宮頸上皮內瘤變Ⅱ級)，相同診斷小于50%[8]。為了提高SIL 診斷的一致性，學者們提出，將一些特異性生物化學指標引入，協助診斷[9]。婦科病理學領域，P16免疫組化已經廣泛應用于宮頸癌前病變的病理診斷中，大量研究資料表明，宮頸病變級別越高，P16陽性表達率越高，P16表達情況與病人病情呈正相關[4,10-11]。本研究發現宮頸炎組中P16陽性表達率為15%，LSIL中P16陽性率為73.33%，HSIL中P16陽性率為95%，p16的陽性表達率隨宮頸病變級別的升高呈上升趨勢，差異有統計學意義(P<0.01)，進一步證實P16是評估宮頸病變的可靠指標，有助于宮頸鱗狀上皮內病變的分級診斷。

Ki-67存在細胞周期中除G0期以外的所有階段，是目前較為肯定的核增殖標志物，研究表明Ki-67表達與宮頸病變的嚴重程度正相關[12]，聯合p16和Ki-67可提高SIL篩查的靈敏度和特異度[13]。本研究結果顯示，Ki-67在宮頸炎中陽性表達率為8.33%，LSIL中陽性率為65.00%，HSIL中陽性率為86.67%，Ki-67的陽性表達率隨宮頸病變級別的升高呈上升趨勢，差異有統計學意義(P<0.01)。與上述研究結果相符。P53是參與細胞周期G1/S期轉換的重要調控分子，與大多數惡性腫瘤相關。P53易發生突變，突變型p53起原癌基因的作用，抑制細胞凋亡并促進細胞惡性轉化[14]。本實驗中P53在正常宮頸上皮中的表達率較低，SIL中表達較高，并且隨著SIL級別增高，P53表達增高，差異有統計學意義(P<0.01)。

本研究通過免疫組化法檢測并分析了p16、Ki-67和P53在HSIL中的表達情況，發現單獨應用p16靈敏度和特異度分別為90%和95.8%，單獨應用p53靈敏度和特異度分別為95%和96.8%，均高于單獨應用Ki-67(86.7%和88.3%)；三者聯合免疫組化檢測后，通過串聯或并聯實驗，其診斷的靈敏度和特異度均優于單獨檢測。但考慮到檢驗成本的問題，對于臨床上可疑高度宮頸病變，而p16、Ki-67檢測不支持HSIL時，建議增加P53免疫組化檢測，最大限度的減少主觀判斷，提高病理診斷的精準度和可重復性，指導個體化治療。另外，本實驗入組的樣本量偏少，本實驗結論有待后期更大樣本統計分析進一步驗證。