Sema4D及相關(guān)炎癥因子在腦梗死患者中的表達(dá)及其相關(guān)性

李 巖,王東玉

(錦州市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 錦州121000)

腦梗死是由于炎癥反應(yīng)破壞血腦屏障，腦部供血發(fā)生障礙而造成腦組織壞死，預(yù)后不良，易導(dǎo)致殘疾甚至死亡，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。隨著飲食結(jié)構(gòu)的變化，人口的老齡化，腦梗死的發(fā)生率也在增加。腦信號(hào)蛋白4D(Semaphorin 4D,Sema4D)主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞以及β細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，通過參與促進(jìn)T細(xì)胞以及β細(xì)胞的活化來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫防御,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)在腦組織缺血過程中可大量表達(dá)；白細(xì)胞介素-6(Interleukin- 6,IL-6)廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)和造血系統(tǒng)中，血管性血友病因子(von Willebrand Factor,Vwf)作為血管內(nèi)皮損傷標(biāo)志，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及凋亡等各個(gè)環(huán)節(jié)，均是炎癥反應(yīng)的標(biāo)識(shí)物[2]。本文探討腦梗死患者Sema4D及炎癥因子水平的表達(dá)意義，分析其與腦梗死的相關(guān)性，探討其指導(dǎo)預(yù)后的價(jià)值，為早期診斷及防治提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 一般材料選取2019年6-12月錦州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科88例腦梗死患者作為觀察組，病程0.50-45.41 h，平均病程(16.68±5.28)h。納入標(biāo)準(zhǔn)[3]：(1)參考1995年通過的《腦血管病診斷標(biāo)準(zhǔn)》；均進(jìn)行CT、MRI檢查確診；(2)發(fā)病48 h內(nèi)入院；(3)通過醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重肝、腎、心功能障礙；(2)血液系統(tǒng)疾病、凝血功能障礙；(3)頭顱手術(shù)史、顱內(nèi)出血、既往卒中史；(4)合并惡性腫瘤、糖尿病。同期體檢健康人群88例作為對(duì)照組，兩組住院資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組人群住院資料比較

1.2 方法

1.2.1治療方法 觀察組使用阿司匹林、腦蛋白活化劑、丹參活血等治療，或者應(yīng)用甘露醇降低顱內(nèi)壓[4]。

1.2.2采集樣本 取4 ml肘部靜脈血， 3 000 r/min，4℃離心10 min，除去死細(xì)胞，分離出血清，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)；繼續(xù)1 000 r/min 分離5 min，提取相關(guān)細(xì)胞，冰箱-20℃保存。

1.2.3檢測(cè)方法 將上清放置37 ℃水浴箱復(fù)融至常溫。ELISA試劑盒(美國(guó) MRC Gene公司)，測(cè)定血漿可溶性Sema4D、血小板表面 Sema4D、外周血淋巴細(xì)胞Sema4D mRNA、vWF、IL-6、TNF-ɑ含量，選用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸收光度值(thermo公司)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)[5]：采用RNA提取試劑盒(美國(guó)ABcam公司)提取細(xì)胞RNA，采用takara試劑(美國(guó)BD公司)盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(引物體系2 μl)，采用PCR試劑盒(美國(guó)corning公司)擴(kuò)增mRNA，流式細(xì)胞儀儀器(貝克曼庫(kù)爾特有限公司)，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的一抗以及二抗。

1.3 觀察指標(biāo)檢測(cè)兩組血漿可溶性 Sema4D、血管內(nèi)皮因子(vWF)、血小板表面 Sema4D、外周血淋巴細(xì)胞Sema4D mRNA、白細(xì)胞介素 6(IL-6)、血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。

2 結(jié)果

2.1 Sema4D水平比較觀察組血漿Sema4D[(1.26±0.43)vs(0.75±0.23)]μg/L、淋巴細(xì)胞Sema4DmRNA[(2.75±0.31)vs(0.46±0.42)]104IU/ml的表達(dá)均高于對(duì)照組，血小板Sema4D 熒光強(qiáng)度[(196.43±35.08)vs(276.45±40.25)]低于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組人群Sema4D表達(dá)水平比較

2.2 炎癥因子含量比較觀察組vWF[(127.15±21.34)vs(111.76±15.23)]、IL-6[(125.23±19.14)vs(103.46±13.35)]、TNF-ɑ[(3.21±1.03)vs(1.85±0.63)]水平高于對(duì)照組(P<0.05)，見表3。

表3 兩組炎癥因子vWF、IL-6、IL-10含量比較

2.3 相關(guān)性分析淋巴細(xì)胞Sema4DmRNA 與vWF、IL-6、TNF-ɑ呈正相關(guān)；血小板表面Sema4D與血漿vWF、IL-6、血清 TNF-ɑ呈負(fù)相關(guān)；血漿Sema4D與TNF-ɑ 呈正相關(guān)(P均<0.05)，見表4。

表4 腦梗死患者相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

急性腦梗死是神經(jīng)內(nèi)科臨床常見疾病，預(yù)后差，嚴(yán)重降低生活質(zhì)量。當(dāng)大腦供血不足時(shí)，腦細(xì)胞活性降低；氧自由基使腦細(xì)胞裂解、凋亡；炎癥反應(yīng)會(huì)加重腦梗死程度。腦梗死發(fā)生發(fā)展是多基因互相作用的結(jié)果，與人體血清IL-6、IL-10和TNF-α因子的異常表達(dá)密切相關(guān)。探討Sema4D與炎癥因子的表達(dá)意義，對(duì)早期診斷、指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后具有重要意義[6]。

3.1 Sema4D的表達(dá)意義

軸突導(dǎo)向因子是一類具有Sema結(jié)構(gòu)域的蛋白超家族，調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)。Sema4D是一種同源二聚體糖蛋白，是免疫系統(tǒng)促血管新生因子， 廣泛表達(dá)于人體的多種組織和器官，可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞活化、遷移，在腫瘤血管新生、血栓形成等發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[7]。其參與T細(xì)胞及B細(xì)胞的活化，參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。Sema4D通過基因敲除后，其體內(nèi)相關(guān)動(dòng)脈血管粥樣斑塊以及血栓形成顯著減少， Sema4D 與體內(nèi)粥樣斑塊的穩(wěn)定型顯著相關(guān)[8]。本研究中觀察組Sema4DmRNA、血漿Sema4D 均高于對(duì)照組，提示血小板過度激活導(dǎo)致Sema4D 釋放入血，相關(guān)核酸以及蛋白水平表達(dá)的上調(diào)，表達(dá)水平未下降至正常水平[9]。同時(shí)血小板表面Sema4D表達(dá)降低，與血漿Sema4D水平負(fù)相關(guān)，與腦梗死的發(fā)生有關(guān)，提示Sema4D不僅參與了腦梗死的發(fā)生，可能發(fā)揮了重要作用，Sema4D是血栓性疾病的一個(gè)危險(xiǎn)因素，檢測(cè)Sema4D對(duì)臨床診斷及治療具有一定的參考價(jià)值。

3.2 炎癥因子的表達(dá)意義

3.2.1vWF作為血管內(nèi)皮損傷標(biāo)志，vWF廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及凋亡等各個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)控，且調(diào)控基因的表達(dá)影響炎性細(xì)胞因子信號(hào)通路來調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)[10]。hs-CRP是由IL-6刺激產(chǎn)生的一種急性期反應(yīng)蛋白，CRP與脂蛋白結(jié)合會(huì)造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和氧自由基過量釋放，出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化，斑塊破裂形成血栓，導(dǎo)致腦梗死的發(fā)生。另一方面，可以誘導(dǎo)MCP-1的產(chǎn)生和減少NOS的表達(dá)，進(jìn)而使血管內(nèi)皮功能出現(xiàn)紊亂，造成循環(huán)纖溶系統(tǒng)失衡，形成血栓[11]。

3.2.2IL-6是一種細(xì)胞分泌的因子，參與調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和介質(zhì)的表達(dá)，其可減輕神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，同時(shí)可參與炎癥反應(yīng)導(dǎo)致繼發(fā)性損傷。正常人群中機(jī)體內(nèi)IL-6的含量很低，腦梗死患者IL-6含量大量增加，表明其在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中與炎癥反應(yīng)及免疫功能紊亂密切相關(guān)[12]，可判定腦梗死面積以及神經(jīng)損傷不良預(yù)后指標(biāo)。

3.2.3TNF-ɑ是一種早期的促炎因子，促炎活性強(qiáng)烈。機(jī)體顱內(nèi)缺血時(shí)，TNF-ɑ就會(huì)大量增加，同時(shí)在刺激下大量分泌一些細(xì)胞炎性物質(zhì)(IL-6、hs-CRP等)，使急性腦梗死的病情進(jìn)一步惡化[13]。作為非特異性的病理性損傷指標(biāo)，觀察組血漿中TNF-ɑ水平顯著的高于健康組，表明TNF-ɑ顯著地參與到了腦梗死的疾病發(fā)生發(fā)展，提示相關(guān)指標(biāo)均可作為腦梗死急性期的標(biāo)志，腦梗死急性期患者血栓形成活躍、纖維蛋白溶解酶原抑制，促進(jìn)了腦梗死急性期的進(jìn)展[14]。本研究中觀察組vWF、IL-6、TNF-α含量高于對(duì)照組，提示在腦梗死進(jìn)展過程中三者均有不同程度的參與，三者可對(duì)于該病的診斷和預(yù)后具有重要參考價(jià)值。

3.3 相關(guān)性分析

外周血淋巴細(xì)胞Sema4DmRNA 與vWF、IL-6、TNF-ɑ呈正相關(guān)；血小板表面Sema4D與血漿Sema4D呈負(fù)相關(guān)；血漿Sema4D與TNF-ɑ 呈正相關(guān)，由于血小板釋放Sema4D入血，上調(diào)Sema4D表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)腦梗死的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)高濃度的 TNF-ɑ可能與血清中 Sema4D具有協(xié)同作用，共同促進(jìn)腦梗死的惡化[15]。

綜上所述，腦梗死血漿中 Sema4D蛋白以及Sema4DmRNA水平表達(dá)均上升、血小板表面Sema4D 降低，同時(shí)炎癥因子IL-6、TNF-α水平升高，提示二者表達(dá)水平可作為腦梗死的生物學(xué)標(biāo)志物，某種程度上也能評(píng)估病情嚴(yán)重程度，作為臨床早期診斷和預(yù)后的有效參考指標(biāo)，并為治療提供有價(jià)值的指導(dǎo)方法。