下調Tetraspanin 8抑制三陰乳腺癌細胞PD-L1表達增強抗腫瘤免疫反應

郝 毅

(吉林大學基礎醫學院，吉林 長春130021)

三陰性乳腺癌(TNBC)缺乏雌激素受體(ER)、孕酮受體(PR)和人表皮生長因子受體2(HER-2)，占所有乳腺癌的15%左右。與其他亞型乳腺癌相比，TNBC患者的總體生存率降低，惡性程度高，侵襲能力強，早期復發率高[1-2]。此外，程序性死亡配體1(PD-L1)在TNBC標本中被發現過度表達，并且與高度惡性和不良的臨床預后相關[3]。在TNBC細胞表面高表達PD-L1抑制T細胞增殖，促進T細胞凋亡，形成免疫抑制微環境[4-5]。已有臨床試驗使用單克隆抗體，如Pembrolizumab或Atezolizumab來阻斷PD-L1與其配體程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)信號，并揭示了其在三陰乳腺癌治療中的有效性[6-8]。這些研究證實PD-L1可以作為TNBC的免疫治療靶點[9]。然而，PD-L1在TNBC中的表達調控機制尚未完全闡明。

Tetraspanin 8(TSPAN8) 屬于tetraspanin蛋白家族，在哺乳動物中該家族由33個成員組成的膜糖蛋白[10]。TSPAN8在包括卵巢癌和胃癌、肝癌、胰腺癌和膠質瘤的多種腫瘤中高表達，促進腫瘤細胞遷移、侵襲和轉移，與患者預后成負相關[11-13]。在乳腺癌中，TSPAN8高表達于大多數原發灶及乳腺癌的腦、骨、肺和肝等轉移灶中。在乳腺癌中，TSPAN8通過增強細胞-細胞粘附、增殖、間充質-上皮轉化、抗輻射和胞外囊泡釋放、增加乳腺癌細胞干性促進乳腺癌發展[14-15]。然而TSPAN8如何調控抗腫瘤免疫反應的機制尚不明確。因此本研究旨在探討TSPAN8在TNBC免疫反應調節中的作用，為全面了解TSPAN8在乳腺癌發展中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，L-15培養基及胎牛血清購至Hyclone公司。TSPAN8抗體購于Abcam公司。PD-L1-PE流式抗體及其同型對照抗IgGk1-PE購于BD公司。

1.2 細胞轉染

TSPAN8的小干擾siRNA-TSPAN8及空白對照病毒由上海吉凱公司構建。將MDA-MB-231細胞調整為1×105/ml，置于6孔板中培養過夜。次日向培養基中添加感染增敏劑Hi trans G P及siR-TSPAN8或空白對照病毒。感染12 h后換液，得到穩定表達的細胞株。

1.3 qRT-PCR法檢測TSPAN8基因表達

將感染空白對照或si-TSPAN8病毒的MDA-MB 231細胞使用TRIzol法提取mRNA，并將其反轉錄成cDNA。使用SYBER Premix EaqTMII試劑盒進行實時定量檢測。引物序列為：TSPAN8(forward):ACTTCTTGTTCTGGCTATGTGG, TSPAN8(reverse):CACAGCAACGTAGGAGCTAGA;GAPDH(forward):GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT,GAPDH(reverse):GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。

1.4 Western blotting法檢測蛋白表達

將感染空白對照或si-TSPAN8病毒的MDA-MB-231細胞使用RIPA法提取蛋白后，使用BCA蛋白定量檢測試劑盒對其蛋白濃度進行定量。每孔蛋白上樣量為30 μg，使用12%的分離膠進行蛋白電泳。結束后將蛋白轉膜至PVDF膜。用脫脂奶粉室溫封閉2 h后，4℃孵育TSPAN8及GAPDH的一抗過夜。次日用TBST清洗后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育1 h。使用化學發光法對蛋白表達進行檢測。

1.5 CCK-8法檢測對細胞的殺傷作用

收集健康志愿者外周血5 ml，使用淋巴細胞分離液分離出PBMC。收集處于MDA-MB-231細胞，將其細胞數調整為1×105/孔，置于96孔板37℃培養。6 h后分別加入E/T為1∶4,1∶8,1∶16的PBMC進行共培養。不與PBMC共培養的MDA-MB-231細胞孔作為對照孔。使用CCK-8檢測試劑盒檢測共培養后24 h、48 h、72 h的殺傷效果。每孔設3組平行孔，實驗重復3次。

1.6 流式細胞術

收集共培養后的細胞，調整細胞數為5×105/管，向其加入CD3、CD4、CD8、CD56抗體，室溫孵育30 min后，對T細胞、NK細胞、NKT細胞所占比例進行檢測。收集5×105個MDA-MB 231細胞，加入PD-L1抗體，室溫孵育30 min后使用流式細胞儀檢測腫瘤細胞表面PD-L1表達。

1.7 統計分析

2 結果

2.1 通過CCLE數據對比乳腺癌細胞系TSPAN8表達

為選取合適的人三陰乳腺癌細胞株作為研究對象，首先通過CCLE數據庫對比人乳腺癌細胞系TSPAN8表達，如圖1所示，多種人乳腺癌細胞系高表達TSPAN8，為探討TSPAN8在三陰乳腺癌中對抗腫瘤免疫的調控作用，選取人三陰乳腺癌細胞系MDA-MB 231細胞用做后續敲除實驗。

圖1 通過CCLE數據庫對比人乳腺癌細胞株TSPAN8的表達水平

2.2 siR-TSPAN8下調MDA-MB 231細胞TSPAN8表達水平

為探討TSPAN8調控乳腺癌抗腫瘤免疫反應的機制，構建siR-TSPAN8及空白對照病毒感染MDA-MB-231細胞，利用qRT-PCR及Western blot方法比較感染對照組(siR-CTRL)或siR-TSPAN8細胞TSPAN8的表達水平。如圖2(A,B)所示，與siR-CTRL相比，siR-TSPAN8組細胞TSPAN8的mRNA及蛋白水平均下調，差異具有統計學意義(P<0.01)。

圖2 siR-TSPAN8下調MDA-MB 231細胞TSPAN8表達水平

2.3 下調TSPAN8增加免疫細胞殺傷MDA-MB-231細胞能力

為了研究TSPAN8的表達是否抑制免疫細胞的細胞毒活性，將感染對照組或者siR-TSPAN8的MDA-MB-231細胞以不同效靶比(1∶4,1∶8,1∶16)與PBMC共培養，用CCK8法檢測細胞殺傷水平。以未與PBMC共培養的腫瘤細胞作為對照，將其細胞活性設為100%。如圖3所示，PBMC對腫瘤細胞增殖具有劑量和時間依賴性的抑制作用。與siR-CTRL細胞組相比，siR-TSPAN8組的細胞活力在效靶比為1∶4,1∶8,1∶16時細胞活性均明顯下降(P<0.01)。結果表明下調TSPAN8的MDA-MB-231細胞增強免疫細胞對其的殺傷活性。

圖3 下調TSPAN8增加免疫細胞殺傷MDA-MB-231細胞能力(**P<0.01)

2.4 下調TSPAN8增加CD8+T細胞比例

為了研究TSPAN8表達主要影響的效應細胞，利用流式細胞分析儀分析了共培養前后T細胞、NK細胞和NKT細胞的比例。結果如圖4所示，與對照組相比，敲除MDA-MB-231細胞中TSPAN8的表達，顯著增加CD3+T細胞和CD8+T(CD3+CD8+)細胞的比例，而CD4+T細胞(CD3+CD4+)、NK細胞(CD3+CD56-)和NKT細胞(CD3+CD56+)的頻率略有下降(P<0.01)。以上結果表明，下調TSPAN8增加CD8+T細胞比例，提示CD8+T細胞可能為TSPAN8主要影響的效應細胞。

圖4 下調TSPAN8增加CD8+ T細胞比例(**P<0.01)

2.5 下調TSPAN8降低腫瘤細胞表面PD-L1表達水平

利用流式細胞分析儀對比對照組與siR-TSPAN8組細胞表面PD-L1的表達水平。使用同型對照染色作為染色對照，PD-L1表達用Δ平均熒光強度(ΔMFI)表示。如圖5所示，與siR-CTRL相比，siR-TSPAN8細胞表面的PD-L1表達水平明顯下降，結果有統計學差異(**P<0.01)。以上結果表明，下調TSPAN8降低腫瘤細胞表面PD-L1的表達水平。

圖5 下調TSPAN8降低腫瘤細胞表面PD-L1表達水平

3 討論

由于缺乏有效的治療靶點，手術和化療作為TNBC的標準治療。PD-L1廣泛表達于多種腫瘤細胞、免疫細胞和上皮細胞中，與腫瘤免疫逃逸密切相關。與其他乳腺癌亞型相比，TNBC高度表達PD-L1，與腫瘤的發生發展和不良預后成正有關[15]。以PD-L1/PD-1為靶點的免疫治療逐漸是TNBC的治療選擇，PD-L1在TNBC中的調節機制也成為近年來的研究熱點。

越來越多的研究指出癌基因參與調節抗腫瘤免疫反應，這同時是癌基因促進腫瘤發生的另一種機制[16]。癌基因通過調節免疫檢查點的表達來抑制抗腫瘤免疫應答。例如，MYC通過直接結合其啟動子來增強PD-L1和CD47的表達，MYC的失活促進TNBC的抗腫瘤免疫反應[17]。也有研究發現其他癌基因，如粘蛋白1(MUC1)和表皮生長因子受體(EGFR)可以誘導PD-L1的表達[18-19]。

TSPAN8高表達于包括乳腺癌在內的多種腫瘤。其表達與多種腫瘤的生長及侵襲轉移相關。然而TSPAN8調節抗腫瘤免疫反應的作用機制尚不明確。本研究證實多種乳腺癌細胞系高表達TSPAN8。與PBMC共培養實驗結果表明，下調TSPAN8增加免疫細胞對TNBC細胞的殺傷水平。流式細胞儀檢測結果表明，下調TSPAN8主要影響CD8+T細胞的比例，并且下調TSPAN8降低腫瘤細胞表面PD-L1的表達水平。以上結果表明，三陰乳腺癌通過高表達TSPAN8誘導PD-L1表達介導的免疫抑制。關于TSPAN8在乳腺癌細胞中調節PD-L1表達的可能機制尚不明確，本團隊將在后續研究中進一步深入探討。