去泛素化酶USP14對炎癥性肺部疾病模型中炎癥反應因子的影響

王 丹，馬奔卉，李 聰，李 超

(吉林大學第一醫院 1.麻醉科；2.二部手術室，吉林 長春130021)

促進炎癥的消退是治療炎癥性肺部疾病的關鍵。長期以來，人們采取種種措施抗感染，清除病原菌，然而隨著各種抗生素的大量應用，耐藥細菌增多，肺部炎癥遷延不愈。Rachel等人[1]發現過表達USP14使去泛素化和降解IκB增多，通過直接調節NF-κB·IκB通路，促進細胞因子的釋放，然而抑制USP14的表達，是否抑制炎性因子的釋放尚不明確。本研究通過下調USP14的表達，抑制LPS或者TNF-α所誘導產生炎性因子的釋放，包括白細胞介素-6(IL-6)或者角化細胞源性細胞因子(KC)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，減輕炎癥反應的程度，報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞培養鼠肺上皮細胞(MLE12)(ATCC,Manassas,VA)是在含有氫化可的松、胰島素、轉鐵蛋白、雌激素、硒、10%小牛血清及抗生素的培養基里，在37℃含有5% CO2的溫箱里孵育。細胞傳代：細胞在培養箱中培養48-72 h后，待細胞融合度達到80%-90%開始傳代。取出細胞，棄去培養基，PBS洗一遍，去除血清和漂浮的細胞，棄去PBS。加入3 ml Trypsin-EDTA(0.25%)，消化約3 min，用移液槍吹打培養皿底部，迅速加5 ml培養液終止消化。收集細胞懸浮液于15 mL離心管中，離心，1 000 rpm×3 min，棄上清，加入新鮮DMEM培養基重新懸浮細胞，將細胞重新分置于培養皿中放入溫箱培養。

1.2 質粒轉染將6 μg質粒和18 μL的SuperFect轉染試劑與Opti-MEM培養液混勻，放置10 min后，加入到細胞融合度達到60%-70%的10 cm培養皿中，放置溫箱中培養48 h。 按照試劑說明書使用Lipofectamine-3000進行siRNA的轉染72 h。

1.3 Western Blot檢測蛋白制備蛋白樣品：細胞按需處理后，提取細胞蛋白。培養箱中取出細胞，棄掉培養液，PBS洗滌細胞2次，棄去PBS，加入適量的細胞裂解液，冰上裂解5 min。用干凈的細胞刷刮取培養皿底部的細胞，收集細胞裂解產物于1.5 mL標記好的EP管中后，在冰上進行超聲波裂解，裂解3次，4℃離心，12 000 rpm×3 min，收集上清即為細胞總蛋白。準備好蛋白標準品、蛋白樣品，采用BCA法測蛋白濃度。電泳：取兩塊SDS-PAGE凝膠板，裝在電泳架上，對應正負極后，放入電泳槽內，加入電泳液，檢查有無漏液。垂直拔出梳子，用槍吸去內槽的氣泡以便上樣。連接正負極進行電泳，跑至marker所有條帶出現并接近玻板下緣停止電泳。轉膜：電泳結束后，取出玻璃板，薄玻片在下，用撬板小心沿厚玻板撬開，切去濃縮膠，依次放上黑海綿、濾紙、膠、PVDF膜、濾紙和白海綿，整體放在轉膜夾上，放入轉膜槽中，注意電極方向，加入轉膜液，插上電極進行轉膜。封閉：轉膜結束后，將PVDF膜轉移到封閉盒中，TBST沖洗液沖洗后加入封閉液，放置搖床上，室溫封閉1 h。孵育抗體：棄掉封閉液，用TBST沖洗2遍，將配制好的一抗浸沒PVDF膜，放置搖床上，4℃孵育過夜。次日回收一抗，TBST洗膜3次，加入稀釋好的二抗浸沒PVDF膜，水平搖床1 h。顯影：回收二抗，TBST洗膜1次，進行曝光顯影。

1.4 ELISA法檢測促炎因子將MLE12細胞取出，接種于6孔板上，顯微鏡下觀察待細胞密度長到60%-70%后按上述轉染步驟進行轉染。不同的實驗分為不同的組別，用LPS(20 μg/mL)或TNF-α(10 ng/mL)處理4 h后，分別收集細胞培養上清至EP管中，4℃離心，吸取上清液。按白細胞介素6(IL-6)、KC、TNF-α的ELISA使用說明書進行操作。從冰箱取出試劑盒，室溫復溫平衡30 min，取酶標包被板，固定于框架上，分別設置標準孔和樣本孔。記錄各孔位置，在標準孔中加入標準品50 μL，待測樣本孔中先加入待測樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL，蓋上封板膜室溫孵育1 h。棄去液體，吸水紙上拍干，加入洗滌液重復洗板3次。每孔加入酶標工作液50 μL，室溫孵育1 h。重復洗板3次。然后進行顯色，每孔先加入顯色劑A液50 μL，再加入顯色劑B液50 μL，混勻后，37℃避光顯色15 min。每孔加入終止液50 μL，終止反應。測定各孔的吸光值(OD值)，最后根據標準品的濃度及對應的OD值，計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應的樣品的濃度，最終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數。

1.5 試劑HA 抗體來源于 invitrogen公司(Carlsbad,CA,USA)。脂多糖(LPS)來源于 Sigma 公司(St.Louis,MO)。TNF-α來源于Mabtech 公司(AmyJet Scientific Inc)。白細胞介素6(IL-6)、KC、TNF-α的ELISA試劑盒均來自于Abcam公司。USP14的小干擾RNA(siRNA)，β-actin抗體均來源于Sigma公司。USP14 抗體來源于Santa Cruz 生物科技公司(Santa Cruz,CA)。HA-USP14 質粒是由Wade Harper(Harvard Medical School)友情贈予。SuperFect轉染試劑和Lipofectamine-3000轉染試劑來源于QIAGEN公司(Hilden,GERMANY)。

1.6 統計學分析采用SPSS16.0軟件對數據進行統計學處理。所有結果采用單因素方差分析進行處理，數據采用均數±標準差表示，數據來源于3次以上獨立實驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 過表達USP14減少IκB的表達并且顯著增加LPS或TNF-α所誘導產生的炎癥因子IL-6的釋放NF-κB信號通路在炎癥性信號通路中起著重要的作用，調節包括細胞因子和趨化因子等炎性因子的表達。為了研究USP14在炎癥肺部疾病中的作用，我們在小鼠肺上皮細胞(MLE12)中過表達帶有被HA標記的USP14(USP14-HA)質粒48 h，并且用LPS (20 μg/mL)或者TNF-α(10 ng/mL)刺激 4 h后，對細胞裂解液進行Western Blot分析，發現過表達USP14-HA減少IκB的表達，并不減少β-actin的表達(如圖1A所示)。同時，收集細胞上清液進行ELISA分析，結果顯示過表達USP14顯著增加LPS或者TNF-α所誘導產生的炎性細胞因子IL-6的釋放(如圖1B所示)。

圖1 過表達USP14對IκB蛋白水平的表達及炎性細胞因子IL-6的釋放的影響

2.2 抑制USP14的表達顯著減少LPS或TNF-α所誘導產生的炎性因子IL-6的釋放在MLE12細胞中，用Usp14 siRNA轉染肺上皮細胞進行基因敲除72 h，并且用LPS (20 μg/mL)或者TNF-α (10 ng/mL)刺激 4 h后，對細胞裂解液進行Western Blot分析，發現USP14的表達顯著被抑制(如圖2A所示)。為了進一步研究抑制USP14對炎性因子的影響。同時，收集細胞上清液進行ELISA分析，結果顯示減少USP14的表達后顯著抑制了LPS或者TNF-α所誘導產生的炎性細胞因子IL-6的釋放(如圖2B所示)。

圖2 抑制USP14的表達對炎性因子IL-6釋放的影響

2.3 USP14的特異性小分子抑制劑IU1顯著抑制LPS或者TNF-α所引起的炎癥反應為了進一步研究USP14對炎癥反應的影響，USP14的特異性小分子抑制劑IU1(100 μM/mL)預處理16 h后，用LPS (20 μg/ml)或者TNF-α (10 ng/mL)刺激 4 h，收取上清液，ELISA結果顯示IU1顯著抑制了LPS或者TNF-α所誘導產生的促炎因子IL-6的釋放(如圖3A所示)。同樣地，IU1預處理16 h后用LPS (20 μg/mL)刺激4 h后，ELISA結果顯示IU1顯著的抑制了炎性因子KC和TNF-α的釋放(如圖3B、3C所示)。

圖3 IU1抑制LPS或者TNF-α所引起的炎癥反應

3 討論

炎癥性肺部疾病是最常見的呼吸系統感染性疾病，其在世界范圍內具有發病率高，死亡率高的特點。盡管對肺炎的防治已有安全有效的抗生素和疫苗，肺炎仍是全球第三大死亡原因及美國第六大死亡原因[2-3]。細菌內毒素(LPS)進入血液循環，結合細胞表面的模式識別受體(PRRs)，主要激活NF-κB和MAPK通路，以巨噬細胞和中性粒細胞為代表的炎癥細胞過度激活，導致炎癥介質過度釋放，大量的促炎介質參與肺部的炎癥反應，造成肺泡上皮細胞、血管內皮細胞及肺泡間質細胞的損傷，導致炎癥反應放大和失控，進而造成肺臟的嚴重損傷[4]。為此，初期所采取各種抗感染和清除病原菌的措施，取得了較好效果。近年來，由于抗生素的廣泛和大量使用，耐藥細菌越來越多，大量使用抗生素不但沒有控制炎癥的進展，同時減弱了機體的免疫防御能力，使肺部炎癥遷延不愈，組織損傷進一步加重[5]。雖然肺炎并非不治之癥，但大量肺炎患者接受抗生素治療效果欠佳甚至無效，致使病情加劇而導致預后不良。因此對肺炎的發病機制、及時控制肺炎炎性反應所帶來的不良預后以及非抗生素類藥物對肺炎的治療作用的進一步探討，具有非常重要的意義。

NF-κB是以p65和p50組成的異二聚體形式存在于細胞內的轉錄因子，參與多種炎性細胞因子的轉錄和調控[6-7]。在靜息狀態下，內源性抑制蛋白IκB-α與P65/ P50二聚體存在于細胞質中，使NF-κB核定位信號呈非活性狀，從而抑制NF-κB移位至細胞核內與相應的DNA序列結合[8]。當上游信號脂多糖(LPS)或者腫瘤壞死因子(TNF-α)激活IκB激酶(IKK)后，活化的IKK會降解IκBα，使得P65/ P50兩個亞單位活化并轉移至細胞核內，與相應的炎性基因相結合，啟動IL-6，KC，TNF-α等炎性相關基因的轉錄和表達，進而導致促炎因子的失衡，誘發炎癥反應[9]。

泛素-蛋白酶體系統(UPS)是細胞內依賴ATP的蛋白質選擇性降解系統，主要降解細胞內80%-90%泛素化的蛋白質(包括錯誤折疊、氧化和受損蛋白質)成為小的多肽，進而調節炎癥、信號轉導、抗原提呈、免疫應答等多種生物功能,與疾病的發生發展關系密切[10]。UPS中的26S蛋白酶體是由桶狀的20S核心顆粒、一或兩個19S調節顆粒和位于19S上的三種去泛素化酶組成，包括Ppn11，Uch37及USP14[11-12]。去泛素化酶分解底物上的泛素鏈進而調節蛋白的穩定性。泛素特異性蛋白酶 14(USP14)屬于半胱氨酸水解酶，是泛素特異性蛋白酶家族(USPs)中唯一一個位于19S蛋白酶體上的去泛素化酶[13]，調節蛋白酶體的活性[14]。越來越多的證據表明，USP14調節各種生物反應，包括神經功能、趨化因子信號和腫瘤的發生[15-17]。最近Rachel K Mialki等人研究發現，USP14通過去泛素化作用調節NF-κB·IκB通路，促進細胞因子的釋放，在炎癥反應中起到重要作用[1]。另外，有研究報道稱抑制USP14可以減少組蛋白乙酰轉移酶(CBP)蛋白的數量進而降低LPS誘導肺上皮細胞中組蛋白的乙酰化水平，最終減少細胞因子的釋放[18]。USP14小分子抑制劑IU1通過減輕肺內炎癥反應可以顯著降低鼠肺機械通氣后的肺損傷[19]。另有研究發現，USP14通過增加細胞外調節蛋白激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化水平，進一步激活NF-κB·IκB通路來調節LPS誘導的炎癥[20]。為了進一步研究USP14對炎癥反應的調節作用，本研究采用脂質體Lipofectamine-3000轉染USP14siRNA敲除USP14，阻斷USP14的去泛素化作用，Westernblot結果表明，與陰性對照組比較，USP14siRNA組USP14蛋白的表達明顯下調，獲得較好的敲低效率，并顯著抑制了LPS所誘導產生的炎癥反應。同樣地，采用IU1抑制USP14的活性后顯著抑制LPS所誘導產生的促炎細胞因子IL-6、KC和TNF-α的釋放。與之前的研究相似，我們過表達USP14顯著減少IκB的表達，并且顯著促進LPS所誘導產生的IL-6的釋放。因此，我們發現下調USP14的表達，抑制LPS或者TNF-α所誘導產生炎性因子的釋放，包括白細胞介素-6(IL-6)或者角化細胞源性細胞因子(KC)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，減輕炎癥反應的程度。另外，IU1抑制USP14活性或敲低USP14，IκB的表達是否增加以及USP14對IκB的分子調節機制有待我們進一步研究。

有研究報道IU1通過減輕肺內炎癥反應可以顯著降低鼠肺機械通氣后的肺損傷[19]，本研究接下來將收集臨床上長期進行機械通氣的并且需要肺泡灌洗的患者的肺泡灌洗液中炎性反應細胞，對其進行IU1處理，觀察其炎性反應變化程度確定IU1的抗炎作用。