Alpha1-抗胰蛋白酶在大腸癌中的表達研究

劉金華，傘湘雯，魏麗萍，楊照微,何成彥

(吉林大學中日聯誼醫院 檢驗科，吉林 長春130033)

大腸癌(Colorectal cancer,CRC)包括結腸癌和直腸癌，是最常見的癌癥死亡原因之一，在消化道腫瘤中具有較高的發病率[1]。但大多數CRC患者發病隱匿，缺乏典型的臨床表現，發現時已是中晚期，嚴重威脅人們的健康。因此CRC的早期診斷及早期干預已成為提高CRC治療療效及改善預后的關鍵。找到對早期發現或篩查有用的特定腫瘤標志物[2-5]，變得尤為重要，所以結腸癌中用于風險評估，早期檢測，預后和替代終點的生物標記物的需求日益增長。本研究選取Ducks’B期腫瘤組織及匹配的組織作為對照組，經蛋白裂解、酶切、洗脫等處理，篩選差異蛋白如下：上調蛋白12個，下調蛋白28個。Alpha1-抗胰蛋白酶(Alpha1-antitrypsin，AAT)作為上調蛋白，作為本研究的目標蛋白，探討AAT在大腸癌診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象選取2019年1月至2020年12月就診于吉林大學中日聯誼醫院的大腸癌患者的組織標本30例。納入標準為：病理診斷明確，病理分期為Ducks’B期，患者性別比例為1∶1。

1.2 試劑與儀器LTQ XL 離子阱質譜儀、電泳儀、Agilent1200 高效液相色譜儀、Tris-HCL、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TMED)、測序級胰酶、碘代乙酰胺(IAM)。

1.3 方法(1)組織樣品處理：將液氮保存的組織標本在液氮中研磨為粉末，稱取適量的粉末，與蛋白裂解液充分混合，冰上孵育30 min，低溫高速離心1 h，吸取離心后的上清，考馬斯亮藍(Bradford)法測定組織樣品的蛋白濃度，其余蛋白裂解液于-80℃冰箱留存。(2)二維質譜色譜聯用技術鑒定蛋白多肽： 0.1%甲酸溶液與制備的蛋白樣品溶解混合，經陽離子交換柱洗脫，LTQ XL離子阱質譜儀檢測洗脫液，再經全掃描及二級掃描獲取質譜數據。(3)免疫印跡鑒定蛋白的表達：將上述蛋白樣品與上樣緩沖液混合，經SDS-PAGE 電泳(80 V，2 h)，轉膜(90 mA，1 h)，封閉，低溫孵育一抗2 h，PBS洗膜5次；室溫孵育二抗1 h，PBS洗膜5次。化學法(ECL 法)發光顯色。

2 結果

2.1 質譜分析Ducks’B期大腸癌組織與癌旁組織的差異蛋白質

將得到的圖譜數據進行分析比對，得到腫瘤組織中的蛋白豐度與癌旁組織的差異性具有統計學意義的蛋白40個，其中Alpha1-antitrypsin蛋白質譜結果見圖1。

圖1 Alpha1-antitrypsin蛋白中DTVFALVNYIFFK序列肽段的串聯質譜圖

2.2 免疫印跡驗證蛋白Alpha1-antitrypsin

選取未經治療的Ducks’B期大腸癌組織與癌旁組織，進行Western blot檢測，結果如圖2所示：Alpha1-antitrypsin在腫瘤組織中的表達量高于癌旁正常組織。

圖2 Alpha1-antitrypsin在Ducks’B期大腸癌及癌旁組織中的表達

3 討論

大腸息肉(CP)包括腺瘤性息肉和非腺瘤性息肉(增生性及炎性)[6]，研究表明[7]：50%-70%的CRC是經大腸息肉(主要腺瘤)-異型增生-癌這一途徑發生發展，腺瘤性息肉被認為是CRC的一種重要的癌前病變，因此及早發現，及時根除大腸息肉是減少CRC發生率的重要途徑。有關研究報道，絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)超家族的某些成員，如纖溶酶原激活物抑制劑-1，與幾種類型的癌癥的不良預后有關[8]。AAT是一種相對分子質量為52000的α1糖蛋白，是一種絲氨酸蛋白酶抑制[9]，因其作為絲氨酸蛋白酶抑制劑的作用而廣為人知，但在體外和體內也被稱為半胱天冬酶3抑制劑，抗凋亡和免疫調節蛋白[10]。AAT是一種急性期蛋白，會干擾細胞凋亡的誘導[11]。多項研究證據表明，更高的AAT水平與癌癥和預后不良相關[12-13]。AAT可能直接參與各種癌癥類型，如卵巢癌，子宮頸癌，結腸直腸癌，乳腺癌和肺腺癌的遠處轉移[14-15]。一些研究者認為，AAT可以用于監測癌癥的發展和人的回應治療因子[16-17]。實驗數據表明，編碼AAT的SERPINA1基因和AAT蛋白的水平對肺癌患者的生存預后有很高的影響[18]。本研究通過二維質譜色譜聯用技術與免疫印跡方法分析Ducks’B期大腸癌組織，發現AAT在Ducks’B期大腸癌中的上調表達。經免疫印跡的驗證，同樣發現該蛋白在Ducks’B期大腸癌中的高表達現象，故本實驗可推測到AAT的過量表達與CRC腫瘤發生發展有一定關聯。

因此結合患者病史、體征等開展AAT對CRC的大樣本檢測，探討AAT在CRC發病機制的相關性及疾病早期診斷、療效觀察等方面具有重要意義。