let-7i對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用機(jī)制分析

張偉娜

(佳木斯市中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科,黑龍江 佳木斯154000)

卵巢癌是婦科較為常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，且該病死亡率很高。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)：我國(guó)每年約有50000例卵巢癌新發(fā)病例[1]。卵巢癌早期無(wú)任何臨床癥狀，且該病早期診斷指標(biāo)特異性不強(qiáng)，使得該病的早期篩查難度加大，從而導(dǎo)致絕大部分患者發(fā)現(xiàn)卵巢癌時(shí)病情已進(jìn)入晚期[2-3]，雖然經(jīng)過(guò)一段的治療，患者病情有所好轉(zhuǎn)，然而患者后期生存率仍然較低，且極易復(fù)發(fā)[4]。所以，應(yīng)探尋特異性較高的指標(biāo)，從而及早發(fā)現(xiàn)并未臨床治療提供一定的依據(jù)。近些年來(lái)，let-7i在腫瘤進(jìn)展中的重要作用備受關(guān)注。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)：let-7i在淋巴癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平較高[5-6]，但是在消化系腫瘤中的表達(dá)水平較低[7-8]。國(guó)外有研究結(jié)果顯示[9]：與良性卵巢腫瘤比較，卵巢癌患者let-7i miRNA表達(dá)水平明顯下降。本研究主要采用臨床基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的方法，著重探討了let-7i對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人卵巢癌SKOV3細(xì)胞以及人永生化卵巢上皮細(xì)胞IOSE均由本院實(shí)驗(yàn)室提供；人卵巢癌A2780細(xì)胞：均購(gòu)自于武漢普諾賽生命科技有限公司。上述細(xì)胞均保存于溫度37℃、二氧化碳(V%)為5%以及飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 主要步驟包括：①首先消化處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，并對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，使用培養(yǎng)基(不含抗生素)于培養(yǎng)板中進(jìn)行接種；次日，細(xì)胞匯合度可達(dá)50%；②使用培養(yǎng)基(不含血清及抗生素)以一定的比例將細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine TM2000與let-7i mimics、let-7i inhibitor及其相應(yīng)的陰性對(duì)照進(jìn)行混合，靜置時(shí)間均為5 min；③將上述按照一定比例混合的轉(zhuǎn)染試劑與miRNA寡聚物充分混勻，靜置時(shí)間為5 min；④將上述混合液加入至培養(yǎng)基之中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2CCK-8實(shí)驗(yàn) 主要步驟包括：①首先消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段的細(xì)胞，并對(duì)這部分細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以每孔規(guī)格為2000個(gè)計(jì)數(shù)將其接種于96孔板之中，100 μL/個(gè)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)為6個(gè)；②次日，將let-7i mimics等轉(zhuǎn)染至細(xì)胞；③轉(zhuǎn)染12-72 h之后，向每孔加入20 μL的CCK-8試劑，培養(yǎng)時(shí)間為2 h；④于波長(zhǎng)為450 nm下使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，然后據(jù)此繪制一套吸光度值與濃度之間的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.3Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 主要步驟包括：①消化、計(jì)數(shù)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，使用不含有血清培養(yǎng)基配制成細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞比例為2.0×105個(gè)/mL)，向每個(gè)Transwell小室孔中加入100 μl的上述細(xì)胞配制液；②將上述小室放于24板孔之中，使用震蕩法將小孔中的氣泡排盡，繼續(xù)培養(yǎng)16 h；③使用棉簽將上述小室中的細(xì)胞緩緩擦去，然后將其置于濃度為4%、體積為600 μl的多聚甲醛之中固定0.5 h；④將細(xì)胞固定液丟棄，使用濃度為0.1%的結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色半小時(shí)，然后將上述染液丟棄，并使用PBS清洗液進(jìn)行清洗數(shù)次；⑤于倒置的顯微鏡下對(duì)上述染色情況進(jìn)行觀(guān)察，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并取均值。

2 結(jié)果

2.1 不同卵巢細(xì)胞中的let-7i表達(dá)水平對(duì)比經(jīng)檢測(cè)，A2780細(xì)胞與SKOV3細(xì)胞中的let-7i表達(dá)水平均分別顯著低于IOSE細(xì)胞(P均<0.05)，但A2780細(xì)胞與SKOV3細(xì)胞中的let-7i表達(dá)水平差異無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同卵巢細(xì)胞中的let-7i表達(dá)水平比較

2.2 let-7i mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的let-7i表達(dá)水平分析對(duì)于SKOV3細(xì)胞及A2780細(xì)胞而言，let-7i mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的let-7i表達(dá)水平均分別顯著高于陰性對(duì)照組(P均<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 let-7i mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的let-7i表達(dá)水平

2.3 let-7i對(duì)細(xì)胞遷移以及侵襲的影響分析(1)let-7i對(duì)細(xì)胞遷移的影響：首先將let-7i mimics轉(zhuǎn)染為卵巢癌SKOV3細(xì)胞，將let-7i 陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染為卵巢癌A2780細(xì)胞，并開(kāi)展Transwell實(shí)驗(yàn)，并于100倍倒置顯微鏡下對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行觀(guān)察、計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示：let-7i轉(zhuǎn)染后SKOV3細(xì)胞以及A2780細(xì)胞數(shù)量均顯著小于let-7i陰性對(duì)照組(P均<0.05)，見(jiàn)表3。(2)let-7i對(duì)細(xì)胞侵襲的影響：首先將let-7i以及l(fā)et-7i陰性對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3細(xì)胞，于200倍倒置顯微鏡下對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行觀(guān)察、計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示：let-7i轉(zhuǎn)染組SKOV3細(xì)胞數(shù)量為(58.28±4.59)個(gè)，顯著小于let-7i陰性對(duì)照組(96.37±10.21)個(gè)(P<0.05)。

表3 let-7i轉(zhuǎn)染組SKOV3及A2780細(xì)胞與let-7i陰性對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量比較個(gè))

3 討論

在2015年國(guó)外有專(zhuān)家學(xué)者應(yīng)用基因芯片技術(shù)從卵巢癌與卵巢良性腫瘤細(xì)胞中鑒定出來(lái)的4種miRNA中，其中就有l(wèi)et-7i，并發(fā)現(xiàn)：該因子在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)水平較低。此結(jié)果表明：卵巢腫瘤惡性程度越大，let-7i表達(dá)水平越低[10-12]。目前，臨床上尚未對(duì)let-7i在卵巢癌發(fā)病中的具體作用機(jī)制予以明晰。本研究開(kāi)展的目的旨在進(jìn)一步弄清該因子在卵巢癌發(fā)病中的作用機(jī)制及其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

本研究主要采用CCK-8實(shí)驗(yàn)以及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)等方法探討let-7i對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用機(jī)制。最初由國(guó)外Mosmann[13]所創(chuàng)立的MTT細(xì)胞增殖方法，由于其具有價(jià)格低廉、放射性低等方面的優(yōu)勢(shì)之處，因此在細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過(guò)程中得到了十分廣泛地應(yīng)用。但是在實(shí)際操作過(guò)程中，MTT還原成地藍(lán)紫色甲瓉具有不溶于水的特點(diǎn)，在換液時(shí)常常會(huì)出現(xiàn)一定的損失，且在這個(gè)過(guò)程中，需要使用對(duì)人體有損傷的有機(jī)溶劑來(lái)對(duì)甲瓚加以溶解。那么，這種方法逐漸被CCK-8實(shí)驗(yàn)所代替，由于CCK-8試劑可以被琥珀酸脫氫酶還原成為的物質(zhì)水溶性較高，無(wú)需細(xì)胞裂解環(huán)節(jié)，那么就可以直接對(duì)let-7i含量加以測(cè)定。本研究中使用的CCK-8實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)let-7i對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖產(chǎn)生的影響，結(jié)果顯示：對(duì)于SKOV3細(xì)胞及A2780細(xì)胞而言，let-7i mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的let-7i表達(dá)水平均分別顯著高于陰性對(duì)照組(P均<0.01)。

機(jī)體的正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞進(jìn)展之中牽涉到細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)地逃避，能夠很好地維持增殖能力與腫瘤轉(zhuǎn)移地獲取等，癌細(xì)胞經(jīng)體腔、血管以及淋巴等路徑轉(zhuǎn)移播散至人體其他部位繼續(xù)生長(zhǎng)，腫瘤直接長(zhǎng)成肉眼可見(jiàn)大小。癌癥患者死亡的最為重要的原因就是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14]。卵巢癌發(fā)病隱匿性較強(qiáng)，目前尚無(wú)一種有效的疾病早期檢測(cè)方法，大多數(shù)患者在確診時(shí)，已處于癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的晚期[15]。所以，應(yīng)該探尋影響卵巢癌細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的具體因素，從而對(duì)卵巢癌遷移、侵襲具有較好的控制效果，有效改善患者預(yù)后狀況。本研究中所使用的Transwell實(shí)驗(yàn)對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲水平進(jìn)行檢測(cè)分析，Transwell小室是一種底部帶有8μm微小孔徑的聚碳酸酯膜的裝置，共分2個(gè)小室，即：上室(不含有血清培養(yǎng)基將癌細(xì)胞接種的位置)、下室(加入完全培養(yǎng)基)。卵巢癌細(xì)胞遷移能力代表的是細(xì)胞自上室穿至下室的數(shù)量大小。本研究中所開(kāi)展的Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，將基質(zhì)膠鋪在上室，于室溫條件下基質(zhì)膠聚合形成具有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)。癌細(xì)胞能夠分泌于腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演重要角色的酶類(lèi)，可以對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白成分加以降解，對(duì)組織學(xué)屏障產(chǎn)生損傷作用[16]。從而將細(xì)胞基質(zhì)膠加以降解，并穿過(guò)小室微孔。該方法已在臨床基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中得到了非常廣泛地應(yīng)用，如Yang等[17]、Li等[18]、Zheng等[19]均應(yīng)用此方法研究腫瘤細(xì)胞的增殖以及侵襲能力。本研究基于Transwell法研究let-7i對(duì)卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力的影響，結(jié)果顯示：let-7i轉(zhuǎn)染組SKOV3細(xì)胞數(shù)量為(58.28±4.59)個(gè)，顯著小于let-7i陰性對(duì)照組(96.37±10.21)個(gè)(P<0.05)。此結(jié)果表明：let-7i在卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有較強(qiáng)的研究意義。

綜上所述，let-7i在卵巢癌發(fā)病過(guò)程中表達(dá)水平下降，且能夠有效抑制卵巢癌細(xì)胞增殖以及遷移等過(guò)程。