MAPKAPK5-AS1/miR-96對乳腺癌細胞轉移的影響及機制

張秀梅 周永華 叢林 劉曙 石明 蘇建軍

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，發病率與死亡率逐年上升，非編碼RNA在基因轉錄表達過程中發揮重要調控作用，有研究表明微小RNA(microRNA，miRNA)可通過靶mRNA結合而調控基因表達從而抑制其翻譯過程，并可調控細胞增殖、遷移及侵襲等過程[1,2]。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)在乳腺癌等腫瘤中異常表達，并可調控腫瘤細胞增殖及遷移[3,4]。因而探討LncRNA/miRNA在乳腺癌發生及轉移過程中的調控機制有助于提高乳腺癌治療效果及改善患者預后。長鏈非編碼RNA MAPKAPK5-AS1(Long non-coding RNA MAPKAPK5-AS1，LncRNA MAPKAPK5-AS1)在肺癌細胞中表達量升高，并可增強肺癌細胞侵襲能力及抑制細胞凋亡[5]。但MAPKAPK5-AS1在乳腺癌細胞發生及轉移過程中的作用機制尚未完全闡明。通過生物信息學分析顯示微小RNA-96(microRNA-96，miR-96)可能是MAPKAPK5-AS1的靶基因，研究表明miR-96在乳腺癌、胃癌等腫瘤中異常表達，并可調控細胞增殖、遷移及侵襲等過程[6,7]。但MAPKAPK5-AS1是否可通過調控miR-96的表達從而參與乳腺癌細胞發生及轉移過程尚未可知。因此，本研究探討MAPKAPK5-AS1、miR-96在乳腺癌組織中的表達及其對乳腺癌細胞增殖及遷移的影響，探究MAPKAPK5-AS1對miR-96的靶向調控作用，為乳腺癌早期診斷及治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 乳腺癌組織及癌旁組織：選取2017年2月至2018年10月我院收治的乳腺癌患者41例為研究對象，患者均經病理證實為乳腺癌，平均年齡(56.35±8.57)歲，患者均接受手術治療，于術中切除乳腺癌組織及癌旁組織，放入液氮中保存，術后轉移至-80℃超低溫冰箱保存。本研究經醫院倫理委員會批準，患者知情且簽署同意書。

1.1.2 試劑：乳腺癌細胞MDA-MB-468購自美國ATCC細胞庫；杜氏改良培養基(DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、Opti-MEM減血清培養基購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000與Trizol購自美國Invitrogen公司；反轉錄與實時熒光定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；MAPKAPK5-AS1小分子干擾RNA(si-MAPKAPK5-AS1)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-96寡核苷酸模擬物(miR-96 mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-96特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-96)及陰性對照(anti-miR-NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；RIPA裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量檢測試劑盒、增強型化學發光試劑(electrochemiluminescence，ECL)購自北京全式金生物技術有限公司；兔抗人增殖標記蛋白細胞增殖核抗原67(Antigen identified by monoclonal antibody，Ki67)抗體購自美國CST公司；兔抗人神經型鈣黏蛋白(N-cadherin)、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組:MDA-MB-468細胞培養于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱培養，0.25%胰蛋白酶消化，制備細胞懸液接種于96孔板(3×105個/孔)，待細胞生長至80%融合度時將培養基更換為Opti-MEM減血清培養基，參照Lipofectamine 2000說明書進行轉染，分別將si-NC、si-MAPKAPK5-AS1、miR-NC、miR-96 mimics、si-MAPKAPK5-AS1與anti-miR-NC、si-MAPKAPK5-AS1與anti-miR-96轉染至MDA-MB-468細胞，分別記作si-NC組、si-MAPKAPK5-AS1組、miR-NC組、miR-96組、si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-NC組、si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-96組，各組轉染6 h后將培養基更換為含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基，繼續培養48 h。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測MAPKAPK5-AS1、miR-96的表達水平:取出凍存乳腺癌組織、癌旁組織及各組轉染后的MDA-MB-468細胞，Trizol法提取總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度。參照反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA。MAPKAPK5-AS1正向引物5’-CGGCACATGGATCTTTCAGG-3’，反向引物5’-TGGCAGAAGGAGTAACAGCA-3’；miR-96正向引物5’-TTTTGCTTGTGTC TCTCCGC-3’，反向引物5’-TCATACGCTACGACTGGCAT-3’；U6正向引物5’-GCTTCGG CAGCACATATACT-3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；GAPDH正向引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，反向引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。以cDNA為模板進行qRT-PCR反應，擴增反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 2 μl，ddH2O補足體系至20 μl；反應條件：95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40次循環。MAPKAPK5-AS1以GAPDH為內參，miR-96以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算MAPKAPK5-AS1、miR-96相對表達量。

1.2.3 平板克隆形成實驗:取對數生長期MDA-MB-468細胞接種于48孔板，按照“1.2.1”分組，每組設置3個復孔，轉染48 h后收集細胞，棄舊培養基，PBS洗滌，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養基制備細胞懸液，調整細胞密度為3×104個/ml，按照每孔200個細胞接種于12孔板，繼續培養，直至出現肉眼可見細胞克隆的形成，移除培養液，PBS洗滌，0.1%結晶紫染色20 min，清水清洗，風干，置于熒光顯微鏡下觀察細胞克隆形成數。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞遷移:取各組對數生長期MDA-MB-468細胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養基制備細胞懸液，調整細胞密度為5×104個/ml，按照每孔200 μl的密度將細胞懸液加入Transwell小室的上室，Transwell小室的下室加入含有10%胎牛血清的培養液(600 μl)，置于37℃、體積分數5%CO2培養箱內繼續培養24 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌，0.1%結晶紫染液染色10 min，顯微鏡下觀察遷移細胞數。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測MAPKAPK5-AS1的靶基因:starBase預測顯示MAPKAPK5-AS1與miR-96存在靶向關系，將含有結合位點及突變位點的序列片段分別插入熒光素酶報告基因載體構建野生型載體WT-MAPKAPK5-AS1、突變型載體MUT-MAPKAPK5-AS1，分別將WT-MAPKAPK5-AS1、MUT-MAPKAPK5-AS1與miR-NC、miR-96 mimics共轉染至MDA-MB-468細胞，置于37℃、體積分數5%CO2培養箱繼續培養48 h，檢測各組熒光素酶活性。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達:取各組對數生長期MDA-MB-468細胞，加入適量RIPA裂解液提取細胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將分離的蛋白凝膠轉移至PVDF膜，封閉，孵育一抗稀釋液(1∶1 000)，4℃孵育24 h，TBST洗滌，孵育二抗稀釋液(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，滴加ECL顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結果

2.1 MAPKAPK5-AS1在乳腺癌中的表達 與癌旁組織比較，乳腺癌組織中MAPKAPK5-AS1的表達水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 MAPKAPK5-AS1在乳腺癌中的表達

2.2 抑制MAPKAPK5-AS1對MDA-MB-468細胞增殖及遷移的影響 與si-NC組比較，si-MAPKAPK5-AS1組細胞克隆形成數顯著減少(P<0.05)，遷移細胞數顯著減少(P<0.05)，Ki67、N-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 Western Blot法檢測Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白的表達

表2 抑制MAPKAPK5-AS1對MDA-MB-468細胞增殖及遷移的影響

2.3 miR-96過表達對MDA-MB-468細胞增殖及遷移的影響 與miR-NC組比較，miR-96組細胞克隆形成數顯著減少(P<0.05)，遷移細胞數顯著減少(P<0.05)，Ki67、N-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表3，圖2。

圖2 Western Blot法檢測Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白的表達

表3 miR-96過表達對MDA-MB-468細胞增殖及遷移的影響

2.4 MAPKAPK5-AS1靶向miR-96 starBase預測顯示MAPKAPK5-AS1與miR-96存在靶向結合位點。見圖3。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，共轉染野生型載體WT-MAPKAPK5-AS1的細胞實驗中，與miR-NC組比較，miR-96組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；共轉染突變型載體MUT-MAPKAPK5-AS1的細胞實驗中，miR-96組熒光素酶活性與miR-NC組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3，表4。

圖3 MAPKAPK5-AS1的序列中含有與miR-96互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5 抑制miR-96能減輕抑制MAPKAPK5-AS1對MDA-MB-468細胞增殖的抑制作用 與si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-NC組比較，si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-96組細胞克隆形成數顯著增多(P<0.05)，Ki67蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 Western Blot法檢測Ki67蛋白的表達

表5 抑制miR-96能減輕抑制MAPKAPK5-AS1對MDA-MB-468細胞增殖的抑制作用

2.6 抑制miR-96能減輕抑制MAPKAPK5-AS1對MDA-MB-468細胞遷移的抑制作用 與si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-NC組比較，si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-96組遷移細胞數顯著增多(P<0.05)，N-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見表6，圖5。

圖5 Western Blot法檢測N-cadherin、E-cadherin蛋白的表達

表6 抑制miR-96能減輕抑制MAPKAPK5-AS1對MDA-MB-468遷移的抑制作用

3 討論

LncRNA不具有編碼蛋白質的功能，可通過競爭性吸附miRNA而調控其靶基因表達從而調控細胞增殖、遷移及侵襲等生物學過程，既往研究顯示LncRNA在乳腺癌中異常表達并可能作為乳腺癌診斷及治療的潛在靶標[8-10]。但仍有部分LncRNA在乳腺癌發生及轉移過程中的作用機制尚未闡明。

MAPKAPK5-AS1在結直腸癌中呈高表達并可通過抑制P21的表達從而促進結直腸癌細胞增殖[11]。沉默MAPKAPK5-AS1表達可顯著抑制肺腺癌細胞增殖[12,13]。本研究結果顯示MAPKAPK5-AS1在乳腺癌結果顯示抑制MAPKAPK5-AS1表達后乳腺癌細胞克隆形成數顯著減少，提示抑制MAPKAPK5-AS1表達可抑制乳腺癌細胞增殖。研究表明Ki67在腫瘤中表達上調，并可促進細胞增殖[14]。本研究結果顯示抑制MAPKAPK5-AS1表達后乳腺癌細胞中Ki67表達下調，提示抑制MAPKAPK5-AS1表達可能通過抑制Ki67表達從而減弱乳腺癌細胞增殖能力。本研究結果顯示抑制MAPKAPK5-AS1表達后乳腺癌細胞遷移細胞數顯著減少，提示抑制MAPKAPK5-AS1表達可抑制乳腺癌細胞遷移。研究表明上皮-間質轉化(EMT)與腫瘤細胞轉移能力密切相關，其中E-cadherin屬于上皮表型標志物，N-cadherin屬于間質型標志物，E-cadherin在腫瘤中表達下調可促使N-cadherin等間質型標志物表達上調從而促進腫瘤細胞遷移及侵襲[15]。本研究結果顯示抑制MAPKAPK5-AS1表達后乳腺癌細胞中N-cadherin表達下調，E-cadherin表達上調，提示抑制MAPKAPK5-AS1表達可能通過調控EMT從而抑制乳腺癌細胞遷移。

miR-96在慢性粒細胞白血病中呈低表達，并可靶向BCR-ABL1表達從而抑制慢性粒細胞白血病的發展[16]。研究表明LncRNA TP53TG1通過充當miR-96的海綿分子從而促進胰腺導管腺癌的發展[17]。相關報道指出抑制LncRNA MALAT1表達可通過上調miR-96的表達從而抑制急性髓樣白血病細胞增殖[18]。本研究結果顯示MAPKAPK5-AS1可靶向調控miR-96的表達及活性，進一步研究顯示miR-96過表達可抑制乳腺癌細胞增殖及遷移，并可促進E-cadherin表達及抑制Ki67、N-cadherin表達，提示miR-96過表達可減弱乳腺癌細胞增殖及遷移能力。本研究將si-MAPKAPK5-AS1與anti-miR-96轉染至乳腺癌細胞，結果顯示細胞增殖能力與遷移能力顯著增強，說明抑制miR-96表達可減弱抑制MAPKAPK5-AS1表達對乳腺癌細胞增殖及遷移的作用。提示抑制MAPKAPK5-AS1表達可能通過上調miR-96表達從而減弱乳腺癌細胞增殖及遷移。

綜上所述，乳腺癌組織中MAPKAPK5-AS1表達量升高，抑制MAPKAPK5-AS1表達可抑制乳腺癌細胞增殖及遷移，其作用機制可能是通過靶向調控miR-96的表達而發揮作用，可為乳腺癌的診斷及治療提供潛在靶點。