miR-3182調控結直腸癌細胞增殖、侵襲、遷移的作用機制研究

木尼拉·馬哈德 哈斯也提·艾力 帕麗達·帕拉哈提

結直腸癌是一種發病率和病死率均較高的惡性腫瘤。近年來隨著生物學技術的進步，結直腸癌患者的預后生存率得到一定的提高，但仍是導致人類死亡率的主要原因之一[1]。臨床上大部分患者確診時，已錯過最佳治療時間，導致預后較差[2]。分子靶向治療具有較強的特異性以及較小的不良反應，因此成為提高結直腸癌患者預后的研究重點。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類含18～25個核苷酸的非編碼RNA，可通過結合于特定基因3，端非翻譯區(Untranslated region，3，UTR)，調節其轉錄或翻譯過程，影響細胞的增殖、遷移和侵襲等生命過程，在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用。miR-3182是近年來新發現的一種 miRNA，其在結直腸癌組織中異常表達，但其對結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響還未知[3,4]。為探究miR-3182在結直腸癌的發生、發展過程中的作用以及分子機制，本實驗從細胞水平進行研究，探討miR-3182對結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及調控機制，以期為結直腸癌病理演進分子機制的進一步闡釋提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗主要材料 結直腸癌細胞系(HCT116、SW480、SW620)購自北納生物有限公司，DMEM培養基、胎牛血清、Trizol試劑購自美國Thermo公司，Lipofectamine 2000購自美國Life Technologies公司，反轉錄試劑盒、熒光定量PCR(Quantitative polymerase chain reaction,qPCR)購自南京凱基生物有限公司，噻唑藍(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)購自美國Bio Basic Inc公司；Transwell小室購自美國Corning公司，miR-3182 模擬物以及對照質粒購自上海吉凱生物有限公司。酶標儀購自美國Bio-BRAD公司，7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 細胞的培養 結直腸癌多種細胞系(HCT116、SW480、SW620)采用含10%胎牛血清DMEM培養基進行培養，置于5%CO2、37℃培養箱孵育，倒置顯微鏡觀察結直腸癌細胞系生長狀態，每2～3天加入胰酶消化、傳代。

1.3 細胞的轉染 選取對數期SW620細胞，隨機分為對照組、miR-NC組、miR-3182組。在Lipofectamine 2000說明書指示下，miR-NC組、miR-3182組分別將對照質粒和miR-3182組模擬物轉染入SW620細胞中，置于5%CO2、37℃培養箱培養，對照組為正常培養的SW620細胞。

1.4 qPCR實驗 采用Trizol試劑提取對照組、miR-NC組、miR-3182組SW620細胞中總RNA，加入反轉錄試劑合成cDNA。以GAPDH為參照，進行qPCR擴增，反應條件設置為95℃ 5 min，95℃ 15 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，40個循環，結果采用2-ΔΔCt法進行計算。其中，miR-3182引物以及GAPDH引物由上海生工合成。見表1。

表1 引物序列

1.5 MTT實驗 收集對照組、miR-NC組、miR-3182組SW620細胞，將(1～3)×103個SW620細胞接種于96孔板，37℃分別培養24 h、48 h、72 h，每孔SW620細胞中加入無血清培養基200 μl以及MTT(5 mg/ml) 20 μl，37℃繼續培養4h，每孔SW620細胞加入二甲基亞砜(Dimethyl sulphoxide,DMSO)150 μl，37℃孵育10 min，振蕩15 min，酶標儀在570 nm測定吸光值，記為A值。

1.6 Transwell實驗 收集對照組、miR-NC組、miR-3182組轉染24 h的SW620細胞，加入無血清培養基重懸，Transwell小室膜中預先覆蓋Matrigel基質膠稀釋液(1∶5 DMEM培養基稀釋)，而細胞遷移實驗Transwell小室無需覆蓋Matrigel基質膠。將200 μl含有2×105個SW620細胞浮液加入Transwell上室，另外將600 μl含10%胎牛血清培養基加入下室，37℃培養24 h；棉花輕輕擦拭Transwell上室，甲醛固定、染色各30 min，拍照、計數5個區域細胞，取平均值。

1.7 靶基因的預測和驗證 采用在線數據庫TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)預測miR-3182下游靶基因，選取與腫瘤生長相關的基因B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)作為研究對象。雙熒光素酶報告基因驗證miR-3182與Bcl-2的靶向關系，野生型(Bcl-2-wt)和突變型(Bcl-2-mut)Bcl-2的3，-UTR熒光素酶報告載體由上海吉凱生物有限公司構建，并分別與miR-3182 模擬物和對照質粒共轉染，37℃培養48 h，收集SW620細胞，測定雙熒光素酶的相對活性。

2 結果

2.1 miR-3182在結直腸癌細胞系中的表達量 與人正常結直腸黏膜細胞(FHC)相比，miR-3182在結直腸癌多種細胞系(HCT116、SW480、SW620)中表達量均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。其中在SW620細胞中的表達量相對較低。見表2。

表2 miR-3182在結直腸癌細胞系中的表達量

2.2 miR-3182模擬物對miR-3182表達量的影響 與對照組相比，轉染對照質粒對SW620細胞中miR-3182表達量無顯著影響，但miR-3182模擬物可顯著增加SW620細胞中miR-3182表達量，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 miR-3182模擬物對miR-3182表達量的影響

2.3 上調miR-3182對SW620細胞增殖的影響 與對照組相比，轉染對照質粒對SW620細胞增殖無顯著影響，但miR-3182模擬物隨著時間的增加顯著抑制SW620細胞增殖，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 上調miR-3182對SW620細胞增殖的影響

2.4 上調miR-3182對細胞侵襲、遷移的影響 與對照組相比，轉染對照質粒對SW620細胞遷移、侵襲無顯著影響，但miR-3182模擬物顯著抑制SW620細胞遷移、侵襲，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5，圖1。

表5 上調miR-3182對SW620細胞侵襲、遷移的影響 個,

圖1 上調miR-3182對SW620細胞遷移、侵襲的影響(×200)

2.5 miR-3182靶基因的預測 Bcl-2 3，UTR區域(4654-4661)部分堿基可特異性結合于miR-3182，表明Bcl-2可能是miR-3182的潛在靶基因。見圖2。

圖2 Targetscan預測miR-3182下游靶基因

2.6 miR-3182靶向調控Bcl-2 miR-3182模擬物與Bcl-2-wt共轉染較miR-NC組與Bcl-2-wt共轉染顯著降低SW620細胞的熒光素酶活性，差異有統計學意義(P<0.05)；但miR-3182模擬物與Bcl-2-mut共轉染與miR-NC組與Bcl-2-mut共轉染對SW620細胞熒光素酶活性無明顯變化。見表6。

表6 雙熒光素酶報告實驗

3 討論

結直腸癌的病理演進過程是一個多階段、多基因參與的復雜生物學過程。在結直腸癌的發生、發展過程中，多個原癌基因以及抑癌基因的表達量發生明顯變化。早期研究證實，在結直腸癌組織生長、轉移過程中，miRNA的表達量發生異常變化[5,6]。miRNA可靶向調節多種在腫瘤發生發展過程具有重要作用的基因，通過降解或者抑制其翻譯，影響其表達量，從而參與腫瘤細胞增殖、侵襲等過程。本項研究發現，miR-3182參與結直腸癌進展，具有抑制結直腸癌細胞增殖、侵襲、遷移的能力。值得注意的是，其作用機制可能與靶向調控結直腸癌細胞中Bcl-2的表達緊密相關，為結直腸癌分子機制的深入研究提供了新的啟示。

近年來研究發現，miR-3182在腫瘤的發生、發展過程中，表達量發生顯著變化，并且調控細胞的增殖、凋亡等生物學特性[7-10]。miR-3182在不同類型的癌癥中起著抑癌或致癌的功能[11-14]，例如，與匹配的癌旁組織或正常成骨細胞系相比，miR-3182在骨肉瘤組織或細胞系中的表達量顯著下調，可通過調控基質金屬蛋白酶-2的表達水平抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和腫瘤生長，進而產生抑制腫瘤的作用。在鼻咽癌的發生發展過程中，miR-3182表達量明顯增加，有助于鼻咽癌細胞發生轉移，可作為預后監測的潛在分子標記物[15]。在三陰性乳腺癌中，miR-3182的表達量降低，通過靶向調節mTOR和S6K1的表達量，影響腫瘤組織的生長。在本實驗中通過qPCR檢測發現，miR-3182在結直腸癌細胞系(HCT116、SW480、SW620)中的表達量降低，與梁高鋒等[7,16]的報道一致，這也表明miR-3182參與結直腸癌病理演進過程。其中在結直腸癌SW620細胞中的表達量相對降低，因此將SW620細胞作為后續實驗對象。此前已有資料顯示，在結直腸癌中，梁高鋒等[7]利用高通量測序檢測到miR-3182表達量明顯降低，但其具體的作用尚不十分清楚。為進一步探究miR-3182的具體作用，本研究將miR-3182模擬物轉染入SW620細胞中，qPCR檢測轉染效果發現，miR-3182模擬物可顯著上調SW620細胞中miR-3182的表達量，說明成功構建上調miR-3182的細胞；MTT和Transwell實驗結果顯示，上調miR-3182的表達量明顯抑制SW620細胞增殖、侵襲、遷移，與前人報道[14]相符，提示miR-3182在結直腸癌病理演進過程中發揮抑癌基因的作用。

Bcl-2是一種常見的癌基因，在腫瘤細胞增殖過程中發揮促進作用，有效抑制細胞的凋亡[17]。研究表明，Bcl-2是細胞多種凋亡信號轉導通路的共同樞紐，在細胞凋亡過程中發揮關鍵作用[18-20]。為進一步探究miR-3182調控結直腸癌細胞增殖、侵襲、遷移的分子機制，本實驗通過在線數據庫預測以及雙熒光素酶報告基因驗證發現，Bcl-2是miR-3182的下游靶基因，表明miR-3182可能通過靶向調控Bcl-2影響結直腸癌細胞增殖、侵襲、遷移。

綜上所述，miR-3182在結直腸癌細胞系中表達量降低；上調miR-3182顯著抑制SW620細胞增殖、遷移、侵襲，其作用機制可能是通過靶向影響Bcl-2表達量；但本實驗僅在細胞水平探究miR-3182的作用以及潛在分子機制，未來會在多株細胞系以及動物實驗中進一步研究miR-3182的具體作用，為結直腸癌的分子靶向治療提供潛在標志物。