黃連素聯合miR-19b-3p調控阿爾茨海默病的實驗研究

岳霞 孫雅麗 楊小敏 宋海燕 賀雯

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)是一種中樞神經系統退行性疾病，β淀粉樣蛋白(β amyloid，Aβ)聚集及細胞內的Tau蛋白的磷酸化是其主要病理改變[1]。根據Aβ毒性蛋白的發病機制，研發靶向Aβ的治療藥物，以期為AD靶向藥物的研發提供新的方向[2]。黃連素，又稱小檗堿(berberine，BR)是從黃連中提取的一種天然的異喹啉類生物堿，研究表明，黃連素具有抗炎、抑制膽堿酯酶活性、抑制Aβ蛋白聚集和Tau蛋白的過度磷酸化等作用[3]。研究報道黃連素可增強膽堿能神經傳遞，改善腦血流量，保護神經元免受炎癥，限制Tau的過度磷酸化并促進β-淀粉樣肽清除[4]。黃連素能明顯改善APP/PS1轉基因小鼠學習記憶能力，減少Aβ42的表達和老年斑的形成[5]。但黃連素對阿爾茨海默病影響的機制還尚不清楚。研究表明miRNA參與神經退行性疾病的發生發展過程，與AD的發病有關[6]。研究報道AD患者中miR-19b-3p表達水平降低，miR-19b-3p的血清水平是AD的有用生物標志物[7]。高表達miR-19b-3p可能通過調節BACE1的表達改善AD患者的認知功能[8]。因此，本實驗通過用Aβ處理PC12細胞，建立AD細胞模型，研究黃連素對AD細胞模型的影響及其是否與miR-19b-3p有關。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細胞購自上海冠導生物工程有限公司；胎牛血清、DMEM培養基購自廣州弗爾博生物科技有限公司；β淀粉樣蛋白(β Amyloid，Aβ)購自武漢純度生物科技有限公司；黃連素購自廈門研科生物技術有限公司；細胞計數試劑盒8(CCK-8)購自杭州仟諾生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒購自上海研謹生物科技有限公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒購自上海經科化學科技有限公司；實時熒光定量PCR檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。

1.2 細胞處理與分組

1.2.1 將PC12細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基中在37℃、5% CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞，10 μmol/L的Aβ處理建立阿爾茨海默癥模型細胞，記為Aβ組，無任何處理的細胞作為對照(NC)組；分別用0.1、1.0、10.0 μmol/L黃連素和10 μmol/L的Aβ處理PC12細胞，記為0.1 μmol/L 黃連素+Aβ組、1.0 μmol/L 黃連素+Aβ(黃連素+Aβ)組、10.0 μmol/L黃連素+Aβ組。

1.2.2 將miR-NC、miR-19b-3p轉染至PC12細胞后再用10 μmol/L的Aβ處理，記為miR-NC+Aβ組、miR-19b-3p+Aβ組；將miR-NC、miR-19b-3p轉染至PC12細胞后再用1.0 μmol/L 黃連素和10 μmol/L的Aβ處理，記為黃連素+miR-NC+Aβ組、黃連素+miR-19b-3p+Aβ組。

1.3 CCK-8檢測細胞增殖 選擇各組轉染后培養48 h的細胞，每孔中加入10 μl CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標儀檢測各組細胞450 nm波長處的吸光度值(OD)。以OD值代表細胞增殖活性。

1.4 蛋白質印跡(Western Blot)法檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達 用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。按照40 μg/孔上樣蛋白，經SDS-PAGE、轉膜、封閉后，洗膜，加入稀釋好的一抗(1∶500稀釋)，室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜，加入按照1∶3 000稀釋的HRP標記的二抗，室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯色，暗室下X線膠片顯影、定影。Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值。蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值。實驗重復3次。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞培養48 h后用預冷的PBS漂洗2次，與500 μl的結合緩沖液混勻。先加入10 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-19b-3p表達水平 各組細胞培養48 h后提取細胞總RNA，將RNA反轉錄成cDNA進行PCR擴增，每個樣品重復3次，循環條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。miR-19b-3p以U6為內參，miR-19b-3p上游引物序列：5’-GTGCAAATCCATGCAAAACTGA-3’，下游引物序列：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTGCT-3’；U6上游引物序列：5’-TCGGCAGCACATATACTAA-3’，下游引物序列：5’-ATGGAACGCTTCACGAAT-3’。

2 結果

2.1 不同濃度黃連素對Aβ處理PC12細胞增殖的影響 與NC組比較，Aβ組細胞OD值和CyclinD1表達水平顯著降低(P<0.05)；與Aβ組相比，不同濃度黃連素組細胞OD值和CyclinD1表達水平顯著升高(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 不同濃度黃連素對Aβ處理PC12細胞增殖的影響

圖1 Western Blot檢測CyclinD1蛋白的表達

2.2 黃連素對Aβ處理PC12細胞凋亡的影響(黃連素：1.0 μmol/L ) 與對照組比較，Aβ組Cleaved-caspase-3表達水平顯著升高，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與Aβ組比較，黃連素+Aβ組Cleaved-caspase-3表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 黃連素對Aβ處理PC12細胞凋亡的影響;A 流式細胞儀檢測細胞凋亡;B Western Blot檢測Cleaved-caspase-3蛋白的表達

表2 黃連素對Aβ處理PC12細胞凋亡的影響

2.3 黃連素對miR-19b-3p表達的影響 與對照組相比，Aβ組miR-19b-3p表達水平顯著降低(P<0.05)；與Aβ組相比，黃連素+Aβ組miR-19b-3p表達水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 黃連素對miR-19b-3p表達的影響

2.4 miR-19b-3p對Aβ處理PC12細胞增殖和凋亡的影響 與對照組比較，Aβ組miR-19b-3p表達水平顯著降低，CyclinD1表達水平顯著降低，Cleaved-caspase-3表達水平顯著升高，細胞OD值顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與miR-NC+Aβ組相比，miR-19b-3p+Aβ組miR-19b-3p表達水平顯著升高，CyclinD1表達水平顯著升高，Cleaved-caspase-3表達水平顯著降低，細胞OD值顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4，圖3。

圖3 Western Blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達

表4 miR-19b-3p對Aβ處理PC12細胞增殖和凋亡的影響

2.5 黃連素聯合miR-19b-3p對Aβ處理PC12細胞增殖和凋亡的影響 與黃連素+Aβ組和黃連素+miR-NC+Aβ組相比，黃連素+miR-19b-3p+Aβ組miR-19b-3p表達水平顯著升高，CyclinD1表達水平顯著升高，Cleaved-caspase-3表達水平顯著降低，細胞OD值顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表5，圖4。

圖4 Western Blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達

表5 黃連素聯合miR-19b-3p對Aβ處理PC12細胞增殖和凋亡的影響

3 討論

有研究報道黃連素可改善三重轉基因阿爾茨海默氏病小鼠的空間學習能力和記憶力，還可以減輕Tau的過度磷酸化[9]。黃連素可能通過活化Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)/核轉錄因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路抑制Aβ25-35誘導的HT22細胞凋亡[10]。黃連素可通過lncRNA β-淀粉樣蛋白裂解酶1反義RNA(β-amyloid cleaving enzyme 1 antisense RNA，BACE1-AS)/miR-132-3p軸保護神經元細胞免受Aβ25-35的侵害[11]。以上研究結果表明黃連素具有改善AD的作用。本實驗用黃連素處理Aβ作用的PC12細胞，結果顯示，CyclinD1表達水平顯著升高，Cleaved-caspase-3表達水平顯著降低，細胞OD值顯著升高，細胞凋亡率顯著降低。說明黃連素可減弱Aβ作用的PC12細胞損傷。

研究報道，肌萎縮性側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)也是一種致命的神經退行性疾病，miR-19b-3p在ALS患者中也下調表達[12]。miR-19b-3p過表達減弱了Aβ誘導的SH-SY5Y細胞活力抑制和細胞凋亡促進，是治療阿爾茨海默氏病的保護劑[13]。本實驗結果顯示，Aβ誘導的PC12細胞中miR-19b-3p表達水平顯著降低，過表達miR-19b-3p可促進Aβ作用的PC12細胞增殖，抑制細胞凋亡。研究報道天然產物抗人通過調控miRNA和自噬延緩阿爾茨海默病的進展[14-19]。本實驗結果顯示，黃連素處理后Aβ作用的PC12細胞中miR-19b-3p表達水平顯著升高。本實驗為研究黃連素是否與miR-19b-3p聯合起作用，本實驗轉染miR-19b-3p的過表達載體的同時用黃連素處理，結果顯示， 黃連素聯合miR-19b-3p也可顯著的抑制Aβ作用的PC12細胞凋亡。

綜上所述，黃連素聯合miR-19b-3p減輕了Aβ誘導的PC12細胞損傷，對阿爾茨海默病模型細胞損傷具有保護作用。