探討食品微生物檢驗菌落總數測定紙片法的應用價值

張俊

（六枝特區疾病預防控制中心，貴州 六枝 553400）

0 引言

民以食為天，食品安全是國家和人民從古自今都十分關心關注的民生問題。食品微生物檢驗菌落總數測定是食品檢驗的最基本的要求之一，其方法的精準程度可以更好地反映食品被微生物污染的程度，市場工作人員可以根據微生物的檢驗結果判斷食品是否滿足市場流通的需求[1]。菌落總數測定紙片法在一定程度上可以幫助研究人員及市場管理人員得到更為精準的食品樣本微生物檢驗結果，提供檢驗的真實性，為后續的食品管理工作打下基礎[2]。

1 資料及方法

1.1 一般資料。選擇國家食品監測項目2019年1月至2020年8月的40例食品樣本作為檢驗對象，分別使用菌落總數測定紙片法以及瓊脂傾注平皿培養計數法測量食品微生物檢驗菌落總數。將菌落總數測定紙片法設置為研究組、瓊脂傾注平皿培養計數法設置為參照組。

1.2 方法

1.2.1 瓊脂傾注平皿培養計數法（參照組）

（1）術語和定義：菌落總數是指食品樣品經過處理，在一定條件下培養后（如培養基成份、培養溫度和時間、PH值、需氧程度等），所得1 mL（g）食品檢樣中所含菌落數。

（2）設備和材料：恒溫培養箱（36±1℃）、天平、恒溫水浴箱（36±1℃）、均質器、無菌吸管及培養皿、放大鏡、無菌生理鹽水等。

（3）培養基：使用上海康潤生物科技有限公司生產的營養瓊脂成品，按要求配制、滅菌后備用。

（4）樣品處理：取樣品25 mL（g）放入含有225 mL滅菌磷酸緩沖液稀釋液（或生理鹽水）的取樣罐或均質杯內，制成1:10的樣品勻液，必要時用1 mol/LNaOH或1 mol/L HCl溶液調節樣品勻液pH至6.6～7.2。用1mL滅菌吸管吸取1:10樣品勻液1 mL，注入含有9 mL稀釋液的試管內，振搖后成為1:100的樣品勻液，以此類推，做出1:1000等稀釋度的樣品勻液，每次換一支吸管。

（5）操作：研究人員根據實驗要求的具體內容，將食品樣本根據采樣環境、食品來源等評估可能的污染程度和檢驗方法標準要求，選擇適當的稀釋度。吸取稀釋液1ml放置在滅菌平皿中，不同稀釋度至少做兩個平行樣，避免誤差存在導致實驗結果的不真實。

研究人員需要等待營養瓊脂充分冷卻，溫度控制在46℃左右時傾注平皿。在制作傾注平皿時，需要將裝滿營養瓊脂培養基的容器放置在（46±1）℃水浴箱內保溫。因為溫度的變化會導致細菌生長出現不同延遲，導致最終的實驗結果不真實，即溫度過高會導致細菌的正常生長繁殖受到抑制，過低會因瓊脂凝固不能與菌液完全融合導致細菌培養過程中沒有足夠的營養供給而阻礙細菌的正常生長。

傾注時以10公分平皿注入營養瓊脂15～18 mL為宜，過厚會導致后續的觀察結果誤差增大，過薄會增加瓊脂自身發生干裂的可能性。傾注后研究人員需要緩慢均勻轉動平皿，確保平皿內的營養瓊脂與樣品充分混合均勻。同時做空白對照：將營養瓊脂培養基傾注到平皿中，然后取出不含樣品1 mL稀釋液滴加在營養瓊脂培養基上。待營養瓊脂培養基凝固之后，將其翻轉放置在（36±1）℃的培養箱內進行培養（48±2）h。

（6）計數：時間滿足實驗要求之后，取出傾注平皿計算菌落數目。選取菌落數在30～300 CFU之間、無蔓延菌落生長的平皿進行計數，將菌落數目乘以稀釋倍數得到最終的樣品所含菌落總數。

1.2.2 菌落總數測定紙片法（研究組）

（1）原理及適用范圍：菌落總數是指樣品經過處理，在一定條件下培養后所得1 mL（g）檢樣或單位面積樣品中所含菌落的總數。菌落總數測試片是一種預先制備好的一次性培養基產品，含有標準的營養培養基，冷水可溶性的吸水凝膠和脫氫酶指示劑氯化三苯基四氮唑（TTC），菌落在測試片上呈紅色。

（2）測定試紙：使用廣東達元綠洲食品安全科技股份有限公司生產的“食品、飲用水菌落測定試紙片”，品牌為綠洲生化、規格為24片/包，產品存放于4℃～10℃冰箱中，保質期為一年，鋁箔袋打開后,未用完的紙片要放回鋁箔袋中封好，放到冰箱中，一個月內用完，試紙符合食品安全國家標準中的食品微生物學檢驗菌落總數測定（GB 4789.2）要求。

（3）操作方法。①樣品處理：與平皿計數法共用。②操作：將菌落總數測試片（BB202）置于平坦實驗臺面，揭開上層膜，用無菌吸管吸取1 mL樣品勻液慢慢均勻地滴加到紙片上，然后再將上層膜緩慢蓋下，靜置10 s左右使培養基凝固，每個稀釋度接種兩片。同時做空白對照。③培養：將測試片疊在一起放回原自封袋中并封口，透明面朝上水平置于（36±1）℃恒溫培養箱內，堆疊片數不超過12片，培養15～24h。④結果判讀：細菌在測試片上生長后會顯示紅色斑點，選擇菌落數適中（30～300個）的測試片進行計數，乘以稀釋倍數后即為每毫升（或每克）樣品中所含的細菌菌落總數。

1.3 指標判定。肉眼或用放大鏡觀察平皿和試紙上的菌落總數結果，多次計數并作記錄。

1.4 統計學分析。將收集到40例食品樣本的相關數據，進行統計學軟件的分析（采用SSPS 26.0軟件分析），40例食品樣本的計數資料以%表示，例n表示，采用χ2檢驗。將得到的數據進行統計學分析，最終結果為P＜0.05，此次的組間差異有統計學意義。

2 結果

對比兩組40例食品樣本的菌落總數結果，組間差異具有統計學意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 兩組40例食品樣本的菌落總數結果情況比較[n（%）]

3 討論

菌落是在細菌培養之后生長繁殖在固體培養基上，且能肉眼可以看見的生長物，當食物樣本被研究人員選擇適當的稀釋度進行相關操作的時候，同時將稀釋液與培養基混合，滿足細菌正常生長條件并培養一段時間之后，基本上每一種適宜環境的細菌都可以在營養瓊脂培養基上形成一個肉眼可見的菌落[3]。研究人員在實際傾注營養瓊脂的時候，一旦發現培基底部存在不明原因的沉淀物，則不能將沉淀物一同傾倒在傾注皿內，需要將存在不明原因的沉淀物棄去，避免后續操作過程中沉淀物的存在對菌落計數觀察的結果帶來負面影響。

瓊脂傾注平皿培養計數法受時間、溫度、pH、營養條件以及需氧影響，需氧菌生長受影響不會很大，而微需氧菌、厭氧菌以及生長要求較為特殊的細菌，由于當前的規定生長要求不滿足其最佳的生長繁殖要求，所以其不能真正的有效繁殖，所以菌落總數并不是真正可以代表營養瓊脂培養基上完全存在的所有細菌總數，同樣，也不能根據肉眼可見的菌落數目對不同的細菌種類進行區分以及鑒別[4-5]。在實際食品樣品檢驗過程中，其結果不能支持食品檢驗工作人員順利開展有效工作。研究人員在進行不同菌種的食品微生物檢驗過程中，需要首先明確自身需要測量的菌種，根據所需測量菌種的實際培養繁殖所需要的條件進行及時的確定，保證后續實驗控制的條件符合該細菌的生長要求[6-7]。

菌落總數測定紙片法被食品管理部門人員用來快速檢驗食品被細菌污染的程度。在實際食品檢驗過程中，研究人員收集一系列食品樣本，根據上述研究內容的具體操作進行適當科學的操作，在對應的時間內就可以得到食品中某部分菌種的污染程度。污染程度是反映食品在生產、流通環節是否符合食品安全的重要指標之一，結果可以更好的為被檢樣品標志著食品衛生質量，并對其做出精準的衛生學評價[8]。菌落總數測定紙片法的結果為市面上流通的食品安全管理工作提供了參考價值，提高了對食品樣品的監測精準度，保證已被檢查食物的潔凈程度[9]。比對兩組檢驗結果，研究組的菌落總數結果明顯比參照組更為精準，組間差異有統計學意義。

綜上所述，食品樣本的菌落總數測定紙片法在一定程度上可以更好的提高食品微生物檢驗的精準程度，得到更為快捷、真實的檢測結果。