熒光定量PCR檢測HBV-DNA與ELISA法乙肝免疫學檢測的探討

周曉瑩，林珠，胡塔，鄺炎波

（廣東省婦幼保健院 檢驗科，廣東 廣州 510010）

0 引言

乙型肝炎病毒是流行最廣，危害最嚴重的病毒性肝炎，在我國，HBV感染人群可達到60%以上，其中乙肝個體中10%可導致慢性攜帶狀態，其中一部分會發展成慢性肝炎，需接受抗病毒治療。臨床表現為惡心、食欲減退、腹部不適和肝區疼痛等癥狀。有些患者還可出現黃疸發熱和肝功能損害，若未進行有效的治療和病情控制，可發展成肝硬化，甚或是肝癌[1]。因此，對乙肝病毒的檢測和診斷就非常重要了。乙肝逐漸成為世界性慢性疾病，在乙肝患者的診斷中，實時熒光定量PCR可通過敏感反應HBV病毒水平，ELISA法能夠對病型進行分型[2]。為了進一步探討HBV-DNA和乙肝免疫學檢測的關系，指導臨床乙肝防治工作，現將乙型肝炎的兩種檢測結果進行分析，現報告如下。

1 資料及方法

1.1 一般資料。研究對象是我院2018年4月至2020年4月在我院檢測的172份HBsAg反應性的血液樣本，所有樣本均行ELISA法乙肝免疫學指標檢測和熒光定量PCR檢測HBV-DNA。在這些標本所屬的患者中，包括男性112例、女性60例，年齡：年齡18～66歲、平均（44.23±4.27）歲，所有患者的HBsAg均為陽性。根據化學發光酶聯免疫檢測方法（ECLIA）檢驗結果的陰陽性進行分組，大三陽組58例[HBsAg（+）HBcAb（+）HBeAg（+）]、小三陽組32例[HBsAg（+）HBcAb（+）HBeAb（+）]、A組38例[HBsAg（+）HBeAg（+）]、B組21例[HBsAg（+）HBeAg（-）]、C組23例[HBsAg（+）HBcAb（+）]。

1.2 方法。所有患者均接受ELISA法檢測和實時定量PCR檢測。ELISA法：儀器：采用深圳愛康公司生產的型號為AE280型的全自動酶免疫分析儀，檢測試劑。一檢試劑廈：門英科新創科技有限公司生產，弱陽性質控品濃度0.5 IU/mL；二檢試劑：北京萬泰生物藥業有限公司，弱堿性質控品濃度0.2 IU/mL。所有患者的血清學檢測均由上述兩個不同廠家的試劑進行兩次檢測，兩次均合格，此項結果合格，單試劑反應性時需進行雙孔復試，任意一孔反應性則為不合格，不合格直接淘汰；雙試劑反應性直接判定該項目不合格；不合格直接淘汰，不再行NAT檢測，對合格樣本行HBV-DNA檢測。檢測項目：乙肝表面抗原（HBSAg）、乙肝表面抗體（HBSAb）、e抗原（HBeAg）、e抗體（HBeAb）、核心抗體（HBcAb）熒光定量PCR法：儀器：科華核酸檢測系統：Hamiltion Star+ABI 7500擴增儀。所用試劑均為傷害科華生物工程有限公司生產，質控品濃度HBVDNA200 IU/mL、HCV-RNA2000 IU/mL、HIVRNA2000 IU/mL，各項操作按照流程進行。

1.3 觀察指標與評價標準。①大三陽組和小三陽組的HBV-DNA比較；②大三陽組和小三陽組的Ct值比較；③A/B/C組與HBV-DNA比較。采用定量法檢測標準：HBsAg＞0.5 IU/mL為陽性、HBsAb＞1.0 IU/mL為陽性；采用標本相對光強度與臨界相對光強度比值檢測HBeAb、HBeAg、HBcAb，HBeAg＜1.0 S/co為陰性；HBeAb＞1.0 S/co為陰性；HBcAb＞1.0 S/co為陰性。

2 結果

2.1 大三陽組和小三陽組的HBV-DNA。大三陽的陽性檢出率為93.10%，小三陽組的為56.25%，有顯著統計學差異，P＜0.05，如表1所示。

表1 兩組大三陽組和小三陽組的HBV-DNA陽性檢出率對比表[n（%）]

2.2 大三陽組和小三陽組的Ct值比較。由檢測結果得知，大三陽組的Ct值顯著高于小三陽組，比較差異具備統計學意義（P＜0.05），如表2所示。

表2 大三陽組和小三陽組的Ct值對比表（±s）

表2 大三陽組和小三陽組的Ct值對比表（±s）

組別 例數 Ct值大三陽 58 37.02±0.04小三陽 32 32.15±0.26 t-105.272 P-0.000

2.3 A/B/C三組與HBV-DNA對比。由檢測結果得知，A、B、C三組的陽性檢測率和Ct值比較均有顯著統計學意義，P＜0.05，如表3所示。

表3 A/B/C三組與HBV-DNA對比表

3 討論

乙型肝炎的流行性、傳染性受世界所關注，它直接增加了使患者發展成肝硬化、肝癌的幾率。在我國，乙肝攜帶者達到將近10%，嚴重威脅著我國居民的身體健康，安全、高效的檢測方法可幫助患者盡早確診，對延緩疾病及疾病的傳播有著重要的作用。當前，用于乙肝的檢測方法較多，有實時熒光定量PCR法、化學發光法、酶聯免疫法（ELISA）等，其中熒光定量PCR法可有效對HBV-DNA在機體復制情況進行測定，操作簡單，有很高的利用率。ELISA法具有操作簡單、成本低、高靈敏度等優勢，但此檢測只能達到定性的效果，無法對HBV感染具體情況進行判斷，臨床上常將ELISA法和PCR法聯合應用[3]。

ELISA法是一種讓抗體和酶復合物結合，通過顯色來檢測的方法，使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，使酶標抗原或抗體既保持酶的活性也保留其免疫活性。臨床上常用ELISA法診斷HBV感染，它檢測的是機體對HBV的免疫反應情況實時熒光定量PCR技術是指將熒光基因加入PCR反應體系，利用熒光信號積累實時監測PCR進程，最后通過曲線對未知模板進行定量分析，PCR是可準確的反映出HBV-DNA的、病程變化、復制水平以及預后判斷等。當HBsAg為陽性，就表示存在HBV感染，如急慢性肝炎或無癥狀攜帶者。

本研究結果中，大三陽的陽性檢出率高于小三陽組，且大三陽組的C值也高于小三陽組，由結果得知，大三陽患者體內的乙肝病毒非?；钴S，有較強的傳染性，同時也反映了HBsAg陽性和HBeAg陽性可對乙肝病毒的感染、傳染得以反應。本研究結果還顯示A、B、C三組的陽性檢出率、Ct值比較，皆有差異，A組的陽性檢出率最高，說明，HBeAg在乙肝患者體內的存在和HBV-DNA有非常緊密的聯系，臨床上可將HBeAg作為乙肝病毒在體內復制的依據，若其轉陰，說明HBVDNA復制水平下降，可用于乙肝治療效果和病情監測指導。若HBeAg為陰性，則患者乙肝病毒量減少，傳染性降低[4]。無論HBeAg是陽性還是陰性，都需定期去醫院復查，特別是HBeAg陽性患者，其乙肝病毒處于復制階段，HBV-DNA濃度也高。HBcAb單一陽性標本，其HBV-DNA為陰性；單純HBcAb陽性中，排除假陽性，可存在HBV-DNA低水平復制。HBsAg陰性HBV-DNA為陽性，提示，HBV的S基因發生突變，說明HBsAg檢測試劑不能檢出HBsAg,PCR檢測在HBsAg出現前檢出HBV-DNA的感染及乙肝病毒的傳染性[5]。

綜上所述，ELISA法檢測免疫學指標，PCR法檢測HBV-DNA，兩種方法結合使用，可更準確的了解患者體內乙肝病毒復制情況，克服單一檢測的局限性，盡早幫助患者確診。