超越CRISPR的新型基因編輯技術RLR

編譯 希區客

2020年11月5日，以色列維茨曼研究所的羅特姆·索雷克（Rotem Sorek）團隊在《細胞》（Cell）上發表論文證實一種名為反轉錄子（Retron）的細菌的遺傳元件同樣也是細菌抵抗噬菌體的防御系統。那么，反轉錄子能否像CRISPR一樣，被開發成強大的基因編輯工具呢？2021年5月，哈佛醫學院喬治·丘奇（George Church）領銜的團隊在這方面有了新進展。

從CRISPR到重組工程

毫無疑問，CRISPR-Cas9基因編輯系統已成為合成生物學領域的創新典范，其帶給人類的影響可用驚世駭俗來形容，但現階段的它仍存在技術缺陷。其中一個極為關鍵的問題在于，雖然研究者可以通過某些設定，用CRISPRCas9尋找并切割特定的目標DNA片段，但切割之后的替換任務需要誘使細胞用新的DNA片段來修復斷裂，而這一“誘導+替換”的過程很復雜，甚至對細胞造成傷害（因為Cas9經常還會切割計劃外的位點，造成脫靶問題）。

近年來興起的一項新型基因編輯技術——重組工程，似乎可彌補CRISPR的缺陷。它執行誘導和替換任務的方式是在細胞復制DNA時引入目標基因片段。所謂“復制”，即DNA的半保留復制過程本就是模板單鏈持續配對堿基最終合成出完整雙鏈分子的過程，因此在這一過程中引入目標突變基因是相當安全的。相比常規CRISPR的“強行替換”，重組工程選擇的“偷梁換柱”可以說是在不破壞DNA的情況下有效地產生了基因突變。下圖為該過程的示意圖。

反轉錄子重組過程示意圖：將含有目標突變（圖中的黑色小段）的反轉錄子序列與反轉錄酶（RT）一起引入細菌細胞。接著，反轉錄子序列由雙鏈分出單鏈，單鏈DNA借助另一種稱為單鏈退火蛋白（SSAP）的酶插入需要引入突變的DNA序列中

此種方法簡單便捷，可同時在許多細胞內開展，以盡可能短的時間創建出盡可能復雜多樣的突變庫，從而為研究人員分析所用。然而有另一個問題無法忽視：大量的突變可以在短時間內生產，但想弄清楚它們具體是什么，那就需要對每個突變體進行分離、測序和表征，而這是一項極為耗時費力的任務。

將重組工程升級為RLR

在此背景下，哈佛大學的Wyss研究所和哈佛醫學院的研究人員創建了一種基于反轉錄子的新型基因組編輯工具，并將其命名為“反轉錄子庫重組工程”（RLR）。RLR讓整個任務變得容易：一方面，它和普通的重組工程技術差不多，可同時生成多達數百萬個突變，快捷高效；另一方面，RLR不只產出突變，更能給突變“編碼”（我們可以將它類比為商品的條形碼），這便于研究者一次性地快速篩查整個基因突變池（更通俗地說就是查找變異基因的速度大大加快），進而輕松生成并分析大量數據。

已有科學家使用RLR技術在細菌細胞中完成了“百萬量級”的基因編輯，并于2021年5月4日在《美國國家科學院院刊》（PNAS）發表論文介紹了他們的工作。

論文作者之一、Wyss研究所的博士后麥克斯·舒伯特（Max Schubert）表示：“RLR讓我們有能力開展CRISPR無法完成的任務。我們隨機‘切碎’一個細菌的基因組，將基因片段原位轉化為單鏈DNA，并同時篩選數百萬個序列。RLR是一種更簡單也更靈活的基因編輯工具，可用于高度重復的實驗，這使得它不僅不像常規的CRISPR那樣具有傷害性，還可大大助力研究人員在基因組水平上探索突變。”

反轉錄子是細菌的DNA片段，可通過反轉錄產生單鏈DNA（ssDNA）片段。科學界發現反轉錄子已有數十年歷史，但這數十年來，研究人員一直不了解反轉錄子產生的ssDNA有什么用。直到2020年6月，終于有團隊發現原來單鏈DNA可以檢測出病毒是否感染了細胞，它是細菌免疫系統的一份子。

最初人們只把反轉錄子視為細菌的某種特例，但過去幾年間，越來越多科學家都將目光投向了這一特例，認為反轉錄子有望如CRISPR那般，在細菌、酵母菌甚至人類細胞的基因編輯方面大展拳腳。

如前文所述，將包含目標突變的單鏈DNA片段整合至原有基因組的方式有兩種。一種是CRISPR-Cas9常用的先切割后替換，另一種則是重組工程技術（包括更高效的RLR）選擇的復制過程引入策略：先把突變序列引入細胞，令其分作單鏈，再借助單鏈退火蛋白把突變整合到基因組中。

新研究的第一作者、加州大學舊金山分校博士后研究員丹尼爾·古德曼（Daniel Goodman）指出，反轉錄對基因編輯的升級是革命性的。正因為它，我們才能先把雙鏈序列引入等待編輯的細胞，接著等待雙鏈自己分解成單鏈，最后完成替換——而不必選擇強行把單鏈導入細胞，不必破壞天然DNA，這著實妙。

反轉錄的另一個吸引人之處在于它們的序列本身可用作“條形碼”，以識別細菌池中的哪些個體已經接收到了哪些反轉錄子序列，進而幫助研究者極為快速地匯總篩選突變菌株。

搭建RLR體系的全過程

為確認反轉錄子是否能實現高效的基因重組，舒伯特和同事首先創建了細菌DNA的環狀質粒，該質粒包含位于反轉錄子序列中的抗生素抗性基因，以及一個單鏈退火蛋白（SSAP）基因。他們將這些反轉錄子質粒插入大腸桿菌，待其經過20代細胞復制后，觀察抗生素抗性基因是否成功整合至大腸桿菌的基因組中。他們一開始的觀察結果并不理想，整合成功的大腸桿菌的比例低于0.1%。

為提高成功率，研究團隊對細菌質粒進行了幾項調整。一方面，他們令細菌的自然錯配修復機制（可糾正DNA復制錯誤）失活，這保證了突變不會在遺傳給下一代之前“修復”。另一方面，他們還滅活了細菌的兩個編碼核酸外切酶（可破壞自由浮動的ssDNA）基因。這些變化極大地增加了成功整合反轉錄序列的細菌比例——從原來低于0.1%增至90%以上。

在反轉錄子的基因整合方面大獲成功后，舒伯特團隊開始測試可否將反轉錄子用作基因測序的“捷徑”——由于每個細菌質粒都有自己獨特的反轉錄序列，這些序列可以充當“標簽”（或者說是“條形碼”）。

此前已經介紹過，所謂的RLR技術就是切開細菌的基因組，將其中某個基因片段原位轉化為單鏈DNA，并用它們一次性篩選數百萬個序列。這里用于篩選的片段就是那個關鍵的“條形碼”，即細菌質粒內某段獨特的反轉錄序列。而用RLR篩選的優勢在于它免去了檢測細菌全基因組的海量工作，只測那段短得多的反轉錄序列即可確定細胞已經接受了哪些突變。

舒伯特團隊的構想相當完美，那么在實操層面，他們是如何打造自己那一套神奇的RLR條形碼篩查體系的呢？

首先，他們測試了RLR技術能否檢測出大腸桿菌體內已知的抗生素耐藥性突變，結果發現，包含耐藥性突變的序列相比其他突變在測序數據中的存在比例高得多；同時他們還確定，RLR具有足夠的靈敏度和精確度，可測量由非常相似的突變所引起的耐藥性方面的微小差異；更為重要的是，通過特定“條形碼”篩查整個細菌基因池（而非對單個突變體進行分離測序）尋找目標突變的效率極高。

接著，研究團隊更進一步，嘗試確定RLR能否用于隨機片段化的DNA檢測篩查，以及他們一次可使用多少個反轉錄子。舒伯特等人切碎了對另一種抗生素具有高度耐藥性的大腸桿菌菌株的基因組，并利用這些片段建立了一個包含數千萬條基因序列（均來自質粒反轉錄子序列）的庫。之后，他們將該基因庫引入經RLR優化的大腸桿菌菌株中進行分析，結果再一次發現，對細菌基因庫進行測序篩查，可以很容易地識別出賦予耐藥性的反轉錄子片段。

論文的通信作者、著名合成生物學家喬治·丘奇表示：“我們能夠通過RLR技術，基于 ‘條形碼’來分析整個突變庫，這讓同時開展數百萬次實驗成為現實，也幫助我們能夠觀察到整個基因組突變的影響，以及這些突變之間如何相互作用。這項工作有助于建立在其他遺傳系統中使用RLR的路線圖，為未來的遺傳研究打開了許多令人興奮的可能性。”

資料來源 harvard.edu