一株豬丹毒絲菌的全基因組測序及SpaA基因分析

彭凌 林錦銓 李玲慧 劉博婷 蔡鞏林

摘要： 本研究測定豬丹毒絲菌臨床毒株SG7的全基因組序列，并運用生物信息學方法對測定的全基因組序列及豬丹毒絲菌表面保護性抗原A基因（SpaA）進行分析。SG7菌株的基因組全長為1 834 291.00 bp，G+C含量為36.3%，基因總數1 846個。將SG7菌株與GenBank中8條完整的豬丹毒絲菌全基因組序列進行比較，發現國內外不同菌株間基因組的基本信息存在不同程度差異。基于全基因組單核苷酸多態性（SNPs）的系統發育分析結果表明，9株菌株聚為3個分支，國內菌株并不完全處于同一分支，SG7菌株與國內常見菌株不屬于同一進化分支。SpaA基因高變區的分析結果顯示，9株菌株亦可分為3個SpaA型，SG7菌株為攜帶Met203的高致病性菌株。除SG7菌株外，其他8株菌株的SpaA基因分型結果與基于全基因組SNPs分析的結果一致，說明SG7菌株的遺傳背景復雜。本研究結果可為豬丹毒絲菌基因組整體水平研究和疫苗的研發奠定基礎。

關鍵詞： 豬丹毒絲菌;全基因組測序;表面保護性抗原A（SpaA）

中圖分類號： S852.61 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）03-0694-05

Whole-genome sequencing and SpaA gene analysis of a Erysipelothrix rhusiopahiae strain

PENG Ling， LIN Jin-quan， LI Ling-hui， LIU Bo-ting， CAI Gong-lin

（Henry Fok College of Biology and Agriculture， Shaoguan University， Shaoguan 512005， China）

Abstract： In this study， the whole genome sequence of Erysipelothrix rhusiopahiae clinical strain SG7 was determined， and the whole genome sequence and the surface protective antigen A （SpaA）gene were analyzed using bioinformatics method. The full length of SG7 genome was 1 834 291.00 bp， and the total quantity of the predicted genes were 1 846 with a G+C content of 36.3%. Different degrees of differences of genomic basic information between different strains were found by comparing the complete genome sequences of SG7 and eight E. rhusiopahiae found in GenBank. Phylogenetic analysis based on genome-wide single nucleotide polymorphisms （SNPs） revealed that nine strains could be clustered into three distinct clades， and strains isolated from China were not in the same clade， while SG7 and common strains isolated from China did not belong to the same clade. The analysis results of hypervariable region of SpaA showed that nine strains could also be divided into three SpaA types， and SG7 was a highly pathogenic strain carrying Met203. Except for SG7， the SpaA genotyping results of other eight strains were consistent with the analytic results obtained based on the genome-wide SNPs analysis， which indicated that the genetic background of SG7 was complex. The results can provide data basis for the research at the whole genome level and development of E. rhusiopahiae vaccine.

Key words： Erysipelothrix rhusiopahiae;whole-genome sequencing;surface protective antigen A （SpaA）

豬丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopahiae）又稱紅斑丹毒絲菌，屬于丹毒絲菌屬（Erysipelothrix），呈纖細桿狀，是一種革蘭氏陽性的人畜共患病病原菌。豬丹毒是由豬丹毒絲菌引發的一種急性、熱性傳染病，能導致家禽、畜類的一系列皮膚感染及敗血癥。人類因外傷局部感染豬丹毒絲菌，會發生類丹毒，感染時手指出現斑點或腫起[1-2]。在20世紀80至90年代，豬丹毒與豬肺疫、豬瘟并稱中國養豬業三大傳染病，給養豬業帶來巨大的損失并影響人類健康[3]。近年來，豬丹毒在中國多個省份均有發生，且發病率呈上升趨勢[4]。

目前預防和控制豬丹毒疫病的主要手段是接種疫苗，傳統疫苗雖然對豬丹毒的預防起到一定作用，但仍有保護率低、保護周期短等缺點。細菌的毒力因子是人們研制新型疫苗的標靶[5]。有研究結果表明，豬丹毒絲菌表面保護性抗原A（SpaA）是其重要的毒力因子[6-7]，可以通過介導豬丹毒絲菌與豬內皮細胞的黏附而侵入宿主發揮作用[7]。同時亦有很多研究結果證實了SpaA蛋白的N端區域為免疫保護區，對豬丹毒絲菌毒株有良好的免疫保護作用[8-10]。全基因組測序是通過DNA測序儀對物種基因進行測序的一種生物信息學手段，全基因組測序分辨率高、分析速度快，為傳染性疾病的調查提供了新的方法，對疫病監測具有重要的指導意義[11]。本研究擬通過測定分離自廣東省韶關市的豬丹毒絲菌毒力菌株SG7[12]的全基因序列，利用相關軟件進行全基因組的注釋分析，并分析SpaA的遺傳多樣性，以期為豬丹毒絲菌的后續研究提供有利的數據支撐，也為新型亞單位疫苗的開發和改良奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

從廣東省韶關市某豬丹毒發病豬場分離獲得豬丹毒絲菌菌株SG7，通過動物試驗鑒定為毒力菌株，半致死量（LD50）為7.3×103CFU[12]。

1.2 基因組的測序與注釋

將得到的豬丹毒絲菌DNA樣品進行Illumina HiseqTM測序，獲得原始圖像數據，再經過堿基識別得到原始測序數據。但鑒于Illumina測序過程中產生的錯誤會對最終的分析結果造成影響，為了數據的準確性，通過軟件FastQC對測序數據質量進行可視化評估，再利用軟件Trimmomatic[13]過濾原始數據，以保證信息分析的準確性。使用軟件SPAdes[14]對得到的測序數據進行拼接，然后對拼接得到的重疊群進行填補空隙。在修正拼接過程中，產生剪輯錯誤及小片段插入缺失會影響分析的準確性，因此需要采用軟件PrInSeS-G[15]進行序列矯正，得到最終的結果。拼接結果采用軟件Prokka[16]進行基因元件的分析預測，同時利用軟件RepeatModeler鑒定SG7基因組上的重復序列。最后，采用軟件NCBI Blast+將蛋白質氨基酸序列與COG、KEGG、VFDB等數據庫的數據進行比對，獲得蛋白質功能注釋信息。

1.3 SpaA基因堿基序列分析

從測定的SG7菌株以及GenBank上公布的豬丹毒絲菌全基因組序列中提取SpaA基因堿基序列，并翻譯為氨基酸序列，根據前人描述的方法[17-18]分析SpaA基因432 bp高變區對應蛋白質N端的氨基酸序列。

1.4 SG7菌株與其他豬丹毒絲菌的比較基因組學分析

對SG7菌株與GenBank上公布的豬丹毒絲菌完整的全基因組序列進行比較基因組學分析，并構建基于全基因組單核苷酸多態性（SNPs）系統進化樹圖。

2 結果與分析

2.1 豬丹毒絲菌菌株SG7基因組的基本特征

表1顯示，豬丹毒絲菌菌株SG7的基因組全長為1 834 291.00 bp，G+C含量為36.30%。組分分析發現，基因總數為1 846個，堿基數為1 685 442.00個，基因平均長度為913.02 bp，占基因組全長的91.89%，蛋白質預測數為1 755個。采用軟件Aragorn預測tRNA，預測數為55個，采用軟件RNAmmer預測rRNA，預測數為3個。利用軟件RepeatModeler對重復序列進行預測，SG7菌株共有107個平均長度為170.30 bp的重復序列，其中DNA重復元件有19個，低復雜度序列有12個，微衛星DNA序列有76個。

2.2 豬丹毒絲菌菌株SG7全基因組的注釋

在豬丹毒絲菌菌株SG7已經預測的1 755個基因中，有1 316個基因注釋到COG數據庫中[19]，占預測基因的74.99%，將這些基因信息依據COG分類標準進行分類，可分為19類;有1 079個基因注釋到KEGG數據庫中[20]，占預測基因的61.48%，可將這些基因劃分為24類代謝通路。

VFDB[21]是專門用于研究致病因子的數據庫，包括SetA和SetB 2部分。將豬丹毒絲菌菌株SG7預測得到的基因堿基序列、蛋白質氨基酸序列與VFDB數據庫中的數據進行比對，把基因和其相對應的毒力因子功能注釋信息結合起來，有108個基因注釋到SetA數據庫，有114個基因注釋到SetB數據庫。

CARD[22]是耐藥基因數據庫，能為藥物作用研究以及環境治理提供研究依據。將豬丹毒絲菌菌株SG7預測得到的基因堿基序列、蛋白質氨基酸序列與CARD數據庫中的數據進行比對，有23個基因注釋到CARD數據庫。

PHI-base[23]是病原與宿主互作數據庫，用于尋找藥物干預的靶基因。將豬丹毒絲菌菌株SG7預測得到的基因堿基序列、蛋白質氨基酸序列與PHI-base數據庫中的數據進行比對，有34個基因注釋到PHI-base數據庫。

2.3 豬丹毒絲菌SpaA基因分析

當前GenBank上公布的豬丹毒絲菌完整基因組序列共有8條，從SG7和GenBank中的8株豬丹毒絲菌的基因組序列中提取SpaA基因432 bp高變區，并對相應蛋白質的N端進行分析，結果表明，9個菌株中有5個菌株為Met203/Ile257型，3個菌株為Ile203/Ile257型，1個菌株為Ile203/Leu257型。

2.4 SG7菌株與其他豬丹毒絲菌全基因組的比較分析

將SG7菌株與GenBank中8株豬丹毒絲菌菌株的全基因組基本信息進行比較，結果（表2）顯示，豬丹毒絲菌全基因組長度為1 752 910～1 945 690 bp，G+C含量維持在36.3%～36.6%，基因數保持在1 708～1 915個，而蛋白質數為1 390～1 801個，表現出較大差異;tRNA保持在55個左右，但不同菌株中的rRNA數量差異較大，SG7的rRNA僅為3個，數量遠低于其他菌株。9個菌株的共有基因為1 234個，特有基因為193個。

將上述8株菌株與SG7菌株的全基因組進行比較分析，并構建系統進化樹圖（圖1），該進化樹含有3個分支，SG7菌株與英國分離株NCTC8163、韓國分離株KC-Sb-R1、中國南京分離株SY1027同處一個分支;而其他4個國內分離株處于第二分支;日本分離株Fujisawa單獨為一個分支。

3 討論

豬丹毒作為一種人畜共患病，給養豬業帶來巨大的經濟損失并影響人類健康，該病的主要預防手段是疫苗接種，但傳統滅活疫苗存在免疫效果不持久，不能產生細胞免疫等局限性[24]。豬丹毒的藥物治療大多采用β-內酰胺類抗生素，但過分依賴抗生素，會導致耐藥性的出現以及藥物殘留的風險[25-27]，有地區就曾分離出豬丹毒絲菌青霉素耐藥菌株[28]。因此，開發更為有效的亞單位疫苗是科學防控豬丹毒的關鍵。盡管從1876年首次分離該菌至今已經過去了100多年，但我們對豬丹毒絲菌分子機制的了解仍然十分有限[29-30]。2011年德國北部暴發大腸桿菌疫情，造成數千人感染，數十人死亡，但病原菌株的病原培養特性和細菌多位點序列分型（MLST）分析結果均與腸出血性大腸桿菌菌株相差甚遠，有學者懷疑是新型的致病性大腸桿菌，經過全基因組測序分析發現，該菌株與腸聚集性大腸桿菌的親緣關系更為接近，在進化上處于同一分支，但在進化過程中獲得了志賀毒素編碼基因stx2及多種耐藥基因，使其獲得了更強的生存能力，造成了病原菌的廣泛傳播[31]。可見，全基因組分析對病原菌株的監測以及遺傳變異檢測有很大幫助，全基因組測序為我們從分子水平研究豬丹毒絲菌提供了便利。

本研究測定了豬丹毒絲菌菌株SG7臨床毒株[12]全基因組序列，并通過使用相關的生物信息學軟件及數據庫對其進行注釋，揭示了該菌株的基因組結構特征，豐富了豬丹毒絲菌的基因組數據庫。將SG7與GenBank上公布的8株豬丹毒絲菌完整基因組序列的基本信息進行比較，除tRNA數和G+C含量比較一致外，基因組長度、基因數、蛋白質數、rRNA數SG7菌株與國內外其他菌株存在不同程度的差異，這也許與不同地區飼養管理以及環境因素等存在差異有關。基于全基因組SNPs的系統發育分析結果表明，9株菌株聚為3個分支，這與Forde等[32]、Ogawa等[18]的研究結果一致。國內菌株并不完全處于同一分支，SG7菌株與南京分離株SY1027、英國分離株NCTC8163、韓國分離株KC-Sb-R1為同一個分支，而南寧分離株GXBY-1、成都分離株ZJ、武漢分離株WH13013、長沙分離株ML101這4個國內分離株則為另一分支，說明國內菌株至少有2個不同的進化途徑，SG7菌株與英國分離株NCTC8163關系最近。SpaA高變區的氨基酸序列分析結果表明，9株菌株可分為3個SpaA型，SG7菌株和南寧分離株GXBY-1、成都分離株ZJ、武漢分離株WH13013、長沙分離株ML101均為Met203/Ile257型。Uchiyama等[17]認為攜帶Met203的分離株為高致病性菌株。Ogawa等[18]對分離自日本的34株菌株進行分析，結果表明這些菌株的SpaA基因分型結果與基于全基因組SNPs分析獲得的分類結果是一致的，本研究中除SG7菌株外，其他8個菌株亦如此。與SG7菌株處同一分支的其他菌株均為Ile203/Ile257型，SG7菌株為攜帶Met203的高致病性菌株（LD50為7.3×103CFU），但它與攜帶Met203的其他菌株不處于同一進化分支，因此推測SG7菌株在進化過程中也許與攜帶Met203的進化分支的菌株接觸后進行了SpaA基因的重組交換。本研究結果為豬丹毒絲菌基因組整體水平研究和亞單位疫苗的開發提供了數據基礎。

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（責任編輯：王 妮）